Gram staion (그람염색)

<그람 염색은 분별 염색 방법이다>

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단순 염색에 이어서, 그람 염색 (Gram-staining)에 대해 알아보겠습니다. 염색의 근본적인 원리는 단순 염색을 설명하면서 알아보았기에 넘어가도록 하겠습니다. 한 가지 짚어보고 넘어가야 할 것이 있다면, 그람 염색은 분별 염색 (Differential staining) 방법 중 하나라는 것입니다. '분별 - 서로 다른 일이나 사물을 구별하여 가름' 이라는 뜻입니다. 미생물의 식별을 용이하게 하기 위하여 두 가지 이상의 생물학적 염료를 사용하는 방법입니다. 그럼 무엇을 구별하느냐! 바로 그람 양성 (gram-positive)과 그람 음성 (gram-negative)입니다. 미생물 중 bacteria... 즉, 세균의 경우 세포벽의 차이에 따라 그람 양성과 그람 음성으로 구분합니다. 그람 양성과 음성의 세포벽 차이는 아래 그림을 보시면 아실 수 있습니다.

(이 그림 전공 서적에 있는 그림인데 이렇게 막 사용해도 될런지...^^;;)

그림을 보시면, 그람 양성균 (gram-positive)은 peptidoglycan 층이 두껍게 형성되어 있고 그람 음성균 (gram-negative)은 lipopolysaccharide와 protein으로 구성되어 있는 outer membrane과 periplasm 층 사이에 peptidoglycan 층이 얇게 형성되어 있습니다. 이 차이를 구별해주는 염색이 그람 염색입니다.
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<그람 염색 방법>
 
1. 균의 도말, 건조, 열 고정은 단순염색 방법과 동일하게 한다.

​​앞서 설명한 '단순 염색' 방법을 참고하셔서 진행하시면 됩니다
 

2.균을 도말한 부위에 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 용액 1~2방울을 떨어뜨린 뒤 1 분간 방치한 후 염색약을 증류수로 씻어 낸다.

크리스탈 바이올렛을 사용하여 1 차적으로 염색합니다. 이 과정을 통해서 그람 양성균과 음성균 모두 크리스탈 바이올렛으로 염색되어 보라색으로 관찰됩니다.
 

3. 그람 아이오딘 (gram iodine) 용액을 도말 부위에 떨어뜨린 뒤 1 분간 처리하고 증류수로 씻어 낸다.

​그람 아이오딘은 매염제 (mordant)로서 작용하여 크리스탈 바이올렛과 함께 복합체를 형성합니다. 크리스탈 바이올렛에 의해 염색된

세포들에 대하여 친화력을 증진시키는 역할을 합니다. 이 과정에서도 그람 양성균과 음성균 모두 크리스탈 바이올렛으로 염색되어 세포가 보라색으로 관찰됩니다.
 

4. 에탄올 (ethanol)로 20~30 초 동안 탈색 후 증류수로 씻어낸다.

에탄올은 탈색제로 사용되는데요, 세균의 세포벽에 존재하는 지방질을 용해시켜 크리스탈 바이올렛과 그람 아이오딘의 화학적 복합체를 떨어져 나가게 합니다.

위의 그림을 보면서 설명하였듯이, 그람 양성균과 그람 음성균의 차이로 peptidoglycan 층의 바깥쪽에 outer membrane의 존재를 말할 수 있는데요,

그람 음성균의 outer membrane의 구성분인 lipopolysaccharide가 바로 지방질이 되겠습니다. 때문에

그람 음성균의 경우 크리스탈 바이올렛과 그람 아이오딘의 복합체가 outer membrane과 결합하여 염색이 되었다가

에탄올에 의해 outer membrane이 용해되면서 크리스탈 바이올렛과 그람 아이오딘의 복합체가 함께 씻겨 내려가게 됩니다.

반면에 그람 양성균의 경우 지방질이 존재하지 않으므로 에탄올에 의해 용해되지 않고 크리스탈

바이올렛과 그람 아이오딘의 복합체가 염색되어 있는 상태를 유지하게 됩니다.

실제 실험을 해보시면 차이가 뚜렷이 관찰됩니다. 그람 양성균은 보라색을 유지하는

반면 그람 음성균은 보라색의 염색 시약이 모두 씻겨져 투명하게 되는 것을 관찰하실 수 있을 것입니다.
 

5. 사프라닌 (safranin)으로 30 초간 대조 염색한 후 증류수로 씻어 낸다.

사프라닌은 염색 과정에서 형성된 크리스탈 바이올렛과 그람 아이오딘의 복합체를 유지하고 있는 그람 양성균에는 영향을 주지 않기 때문에 보라색을 유지하게 됩니다. 반면 그람 음성균의 경우 크리스탈 바이올렛과 그람 아이오딘의 복합체가 씻겨진 상태이기 때문에 사프라닌에 의해 붉은색으로 염색됩니다.
 

6. 표본 위의 물기를 제거하고 관찰한다.

자, 방법들 아래에 단계별 원리에 대해 설명을 하였는데,,이해가 충분히 되시는지요? 위와 같은 원리와 과정을 거쳐 결론적으로 그람 양성균은 보라색으로, 그람 음성균은 붉은색으로 염색이 되는 것입니다. 실험 방법을 요약하여 그림으로 설명한 것을 아래에 첨부합니다. 글보다는 그림으로 실험 과정을 이해하시기에는 더 좋으실 것입니다.

 

[출처] 그람 염색 (Gram staining)|작성자 jisung