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ASO검사

ASO 검사는 그 중에서도 특히 중요한 A군 용혈성연쇄상구균이라는 세균의 감염으로 생기는 항체를 측정하는 검사입니다. 특히 감염의 후유증인 류마티스열, 사구체 신염의 진단에 유용하고 감염 후 4-6주간 간격으로 검사한 결과 2배 이상의 상승이 인정되면 진단할 수 있으며 빠른 진단과 치료를 위해 이 검사가 필요합니다.

급성편도선염, 인후두염은 소아나 성인이 자주 걸리는 병으로 대개는 바이러스 감염증이고 약 10∼20%는 세균 마이코프라스마입니다. 세균 감염 중 가장 중요한 원인균이 연쇄상구균입니다. 이 세균은 몸에 염증과 화농을 초래하는 대표적인 감염증의 세균으로 현미경으로 보면 그 이름으로 알 수 있듯이 목걸이 같은 모양을 하고 있습니다.

▶ 이상치를 보이는 주요 질환 :

급성류마치스열, 급성사구체신장염, 성흥열, 급성편도선염, 만성관절류마치스

성홍열

A군 사슬알균 중 외독소를 생성하는 균주에 의한 상기도 감염증(인후염) 발생시 인후통(목의 통증), 발열 및 전신에 퍼지는 닭살 모양의 발진을 보이는 급성 감염성 질환이다. 주로 3세 이상의 소아에서 발생하게 되며 발열 및 인후염이 있는 환아에서 신체 검진상 전형적인 발진과 함께 딸기 모양의 혀 모양이 있을 시에 임상적으로 진단을 할 수 있다.

류마티스열

A군 용혈성 연쇄상 구균 감염후 1~3주에 발생하는 경우가 많은 결합조직의 염증을 특징으로 하는 전신성 비화농성 질환으로 대부분은 관절, 심장, 신경계를 침범하는데 타장기도 침범된다. 즉 심염(심잡음, 심장확장, 심막염, 심부전), 다발성 관절염, 소무도병 등을 일으키고 환자의 혈청중에 각종 항체(ASO, ASK, AH)가 출현하고 CRP의 양성화, 혈액침전의 촉진, 백혈구증다증 등이 발생된다.

사구체신염

신장의 사구체에 범발성으로 일어나는 염증성 질환. 급성 사구체신염은 주로 연쇄상구균감염증에 연속해서 발생하며, 항원항체반응에 의하여 발생하는 비만성의 신장질환이다. 상기도감염의 1~2주 후에 혈뇨, 부종, 고혈압 등을 동반하며 발병한다.

◆검사로 알 수 있는 것

용혈성연쇄상구균은 적혈구를 파괴하는(용혈시키는) 스트렙토라이신이라고 부르는 독소를 냅니다. 이 독소는 산소에 의해 불활성화되기 쉽기 때문에 "스트렙토라이신-0"라고 부릅니다. 용혈성연쇄상구균에 감염되면 체내에서는 그것에 대한 방어반응으로 항스트렙토라이신-0 항체라고 하는 항체가 생긴다. 그러므로 환자의 혈청에 용혈성연쇄상구균과 적혈구를 가해서 혈청 중의 항체값을 측정하여 용혈성연쇄상구균 감염 여부를 조사합니다.

사슬 알균은 Streptolysin O 라는 물질을 분비한다. Streptolysin O가 체내에 생기면 인체는 B 세포에서 이에 대항하는 antistreptolysin O (ASO) 라는 항체를 만들어 낸다. 이 항체는 균주 억제역활을 하지는 않는다.

이 항체는 사슬알균 감염 후 1주 내에 증가하기 시작하여 3-6주후 최고치에 이른 후 점차 떨어진다. 그러나 많은 수의 소아에서는 12개월 동안 높은 수치를 유지하기에 검사 결과 해석에 유의하여야 한다.

이런 변화는 다른 항원이 인체내에 침입했을 때 경과와 유사하다. 이런 ASO를 1932년 처음 측정되었다.

모든 소아에서 일괄적으로 적용할 수 있는 수치는 없다. 두가지 방식으로 정상 범위를 제시하는데 한 방법은 80 백분위수, 다른 한 방법은 평균에서 2 표준편차 이상 벗어난 경우이다. 

80 백분위수를 사용하는 이유는 급성 신 부전증이나 사슬알균 감염후 토리콩팥염에 감염된 환자 80-90%가 정상 대조군보다 80 백분위수에 벗어나 있다. 이를 정상상한치로 한다.

국내 연구자를 포함하여 많은 연구자들이 정상 수치를 제시하였다. 나이에 따라 수치가 달라질 수 있다.

국내 연구자 결과는 다음과 같다.(80 백분위수 값)

	이지헌 등, 2007		김선주, 1997		차성호, 등 1995
신생아	122	초등생, 진주	433	0-5세	52
0-3세	40			6-8세	431
4-6세	113		김선주 등, 1994	9-11세	572
7-9세	489	초등생, 충남	499	12-14세	368
10-19세	433	초등생, 서울	326	15-17세	263
20-29세	122

이 정상 수치로 보아서 200 - 400 IU/mL 를 정상 범주로 잡고서 임상 증상과 같이 해석을 해야 할 것이다.

검사를 두번 하여 초기 감염 때와 합병증이 나타날 때 쯤인 10-14일 후 검사 수치가 4배 이상 증가하면 진단이 가능하다.

• 급성 인두염 환자에서 ASO 검사가 유용한가?

급성 인두염은 배양검사 또는 급속 항원 검사로 사슬알균을 진단해야 한다. 그러나 이 두 검사는 실제 감염과 보균자(대략 10% 정도)를 감별하지는 못한다.

그렇다고 하더라도 ASO 수치가 사슬 알균에 감염 후 상승하는 것에 시간 간격이 있는 것을 고려 한다면 급성 인두염에서 ASO는 진단으로 권고하고 있지 않다.

향후 사슬 알균의 합병증이 의심되는 소견을 보였을 때 참조치로서 유용할 수는 있다.

• 사슬 알균의 비 화농성 합병증에는 무엇이 있는가? 

사슬 알균 감염 후 몇주 이내에 균주와의 자가 면역 반응에 의해 발생할 수 있는 비 화농성 합병증은 다음과 같다.

1. 급성 류마티스 열 (acute rheumatic fever)

2. 류마티스 심장병 (rheumatic heart disease)

3. 사슬알균감염후 토리콩팥염 (poststreptococcal glomerulonephritis, APSGN, 연쇄구균감염후 사구체 신염)

4. 사슬알균감염후 반응성관절염 (poststrpetococcal reactive arthritis)

5. 사슬알균연관 소아자가면역 신경정신 질환 (pediatric autoimmune neuropsychiatric disorder associated with streptococcal infection, PANDAS)

6. 사슬알균감염후 포도막염 (poststreptococcal uveitis)

7. 사슬알균감염후 피부혈관염 (poststreptococcal cutaneous vasculitis)

• 비 화농성 합병증을 진단하는데 ASO 검사는 유용한가?

유용하다.

사슬알균 감염 후 합병증간에 시간 간격이 있고, 감염 균주가 바이러스 일 수도 있으며, 보호자 기억력이 명확하지 않을 때가 많고, 무증상으로 지나갈 수도 있기에 과거 감염 여부를 확인할 수 있는 객관적인 자료는 혈청 검사밖에 없다.

급성 류마티스열 진단에 활용하는 진단 기준에 ASO가 포함되었지만 20% 환자에서는 음성 반응을 보일 수 있기에 류마티스열이 의심되는 환자에서는 반복 검사를 해야 한다.

또는 이를 확인할 수 있는 anti-DNase B 검사를 같이 하면 진단율이 높아진다. 이는 사슬알균감염후 토리콩팥염에서도 유사한 민감도와 특이도를 보인다.

그러므로 이런 환자들에서는 ASO와 anti-DNase B 검사를 시행해야 한다.

Agarose gel은 전기영동에 쓰이는 것으로 DNA가 이동하는 매질의 역할을 한다.

DNA를 고정하는 능력이 우수하여 DNA를 분자량에 따라 분리해내기가 용이하다.

제조 준비

① 1 × TAE Buffer, Ethidium, Agarose

② 전자레인지, 방열장갑, 수평계

제조 과정

1. 제조과정에 쓰일 물품들을 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 닦는다.

2. Buffer를 비커에 넣고 Buffer 무게의 1/100에 해당하는 Agarose를 비커에 넣는다.

→ 이 때 Gel에 들어가는 성분들의 비율은 다음과 같다.

 3. 2의 삼각플라스크를 전자레인지에서 가열한다. 5초 혹은 10초 간격으로(비커 안의 내용물이 끓어 넘치지 않을 정도의 시간) 삼각플라스크를 꺼내서 플라스크를 바닥에 닿게 하여 천천히 돌려주면서 식힌다. 살짝 식으면 다시 집어넣고 내용물이 투명 해 질 때까지 반복한다.

4. 3의 과정이 끝난 플라스크에 Etidium Bromide의 정량을 집어 넣는다. 

5. Gel 주형틀의 수평을 맞추고 Gel을 붙는다. 

6. Kimps등의 실험용 휴지로 위를 덮어서 먼지가 내려앉지 않게 한다.

혈액 ,수혈 실습 계획서.pptx

14 남서 혈액 수혈 실습 계획서

수혈의학 실습 보고서

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▶ ABO, Rh 혈액형 검사 (혈구형 / 혈청형)

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 실험 목적 : 혈액의 ABO항원과 Rh항원의 유무 판별.

 준비물 : EDTA tube, 채혈도구, Anti A,B,D(Rh) 시약, 원심분리기, 혈청분리관, 피펫, 1.5ml tube, 15ml tube

 총 사용 혈액 : 실험자 혈액 EDTA 1통 A형 EDTA 1통, B형 EDTA 1통.

 실험 방법1 (혈구형)

실험자 혈액(EDTA)샘플을 2,500rpm에 5분간 원심시킨다.

혈청 분리관으로 혈장을 옮겨놓고(혈청형 검사때 사용), Buffy coat층을 제거한다.

생리식염수로 3회 세척한다.

세척 적혈구를 이용하여 50% 혈구 부유액을 제조한다.

혈액형 검사 Plate에 제작한 50%혈구 부유액을 각각 200ul씩 떨어뜨리고 혈구형 검사 시약 3가지를 동량 넣는다. (pipet 이용)

Applicator로 시약과 혈액을 섞어서 결과를 관찰한다.

 실험 결과

  실험 방법2 (혈청형 Plate법)

혈구형 검사 실험과정 1~3번처럼 A,B형 세척 혈구를 만든다.

세척혈구로 A,B 5% 혈구 부유액을 제작한다. (세척혈구 500ul + 9.5ml Saline)

혈구형 검사 실험과정 2번에서 얻은 실험자 혈장을 Plate에 100ul씩 2곳에 떨어뜨린다.

각각의 혈장에 5% A,B 혈구 부유액 100ul를 넣어준다.

어느정도 반응시간 (약 30s~1min)을 주고 applicator로 섞어준 뒤 결과를 관찰한다.

 실험 결과

  실험 방법3 (혈청형 Tube법)

시험관 두 개에 각각 A와 B로 표시한다.

A 시험관에는 A cell, B 시험관에는 B cell 5%부유액을 혈청 분리관으로 한방울 넣는다.

3. 실험자 혈장을 2방울 넣는다.

4. 시험관을 잘 혼합한 후 3,400rpm에 15초간 원심분리한다.

5. 상층부에 용혈 유무 확인 후 시험관을 기울려 응집 유무를 관찰한다 (살짝 흔들어 본다)

※살짝 흔드는 이유는 원심분리하면 응집되지 않는 샘플도 가라앉아 응집된것처럼 보이기 때문이다.

 실험 결과

 최종 결과 판독

ABO판정 : A

Rh판정 : Rh+

 최종 결과 토의

-D항원(Rh)검사에서는 ABO보다 역가가 낮아서 응집력이 Anti-A에서보다는 낮았다.

-혈청형 검사는 Plate법보다 시험관법이 더 결과관찰이 용이했다.

▶ 아형 검사

 실험 목적 : 인위적으로 만든 아형이 혈액형 검사에서 어떤 성상을 나타내는지 본다.

 준비물 : EDTA tube, 채혈도구, Anti A,B,D 시약, 원심분리기, 혈청분리관, 피펫, 1.5ml tube, 15ml tube, 12ml 시험관,

 총 사용 혈액 : 실험자 혈액EDTA 2통 (A Rh+)

 실험 방법1 (혈구아형 제작)

채혈한 혈액을 2,500rpm에 5분간 원심분리하고 혈장을 옮긴다.

Buffy coat층을 제거하고 Saline으로 3회 세척한다.

세척한 혈구를 1.5ml tube에 200ul 옮긴다.

Saline을 200ul 첨가하여 혈구을 희석한뒤 마찬가지로 계대 희석으로 x2,4,8,16,32 희석한 혈구를 만든다.

 실험 방법2 (혈장아형 제작)

원심분리하여 얻은 혈장을 깨끗한 l.5ml tube에 200ul를 분주한다.

Saline으로 계대희석하여 2~32배 희석혈장을 제작한다.

 실험 방법3 (아형 혈구형 검사)

제작한 아형 혈구 샘플로 50% 혈구 부유액을 제조한다.

혈액형 검사 Plate에 제작한 50%혈구 부유액들을 각각 100ul씩 떨어뜨리고 혈구형 검사 시약 3가지를 동량 넣는다. (pipet 이용)

Applicator로 섞어준 뒤 결과를 확인한다.

 실험 결과

  결과 토의

희석한 배율이 커질수록 응집력이 작아졌다.

D항원(Rh)의 역가가 ABO보다 낮기 때문에 응집력에서 차이가 있다.

이 결과를 토대로 항원수가 부족한 A형 아형(A1,A2,A3...등)과 Weak D같은 아형을 생각 할 수 있다.

 실험 방법4 (아형 혈청형 검사)

제조한 아형 혈장 샘플당 2개의 시험관을 준비한후 각각 A,B를 표시한다.

각 시험관에 아형혈장을 종류별로 200ul넣어주고 A,B 5% 혈구 부유액을 100uL씩 넣어준다.

조심스럽게 혼합한 후 3,400rpm에서 15초간 원심분리한다.

원심분리 후 용혈 유무 확인 후 시험관을 살짝 흔들어준 후 기울려 응집 유무를 관찰한다.

 실험 결과

 결과 토의

A형 혈액의 혈장을 사용하여 A cell에서는 응집을 관찰 할 수 없다.

희석 배수에 따라 응집력이 낮아졌다. (단 원액과 2배희석 혈장의 응집 여부는 크게 차이가 없었다)

혈장이 희석될수록 항체수가 줄어든다는 것을 알 수 있다.

8. RBC count : Anemaia, leukemia 진단

① 0.85% NaCl, Hayem's Sol. Gawor's Sol. Dacie's Sol. Strong's Sol. Toison's Sol.

② Hayem's solution : Sod. sulfate(Na2SO4), Sod. chloride(NaCl), Mercuric chloride(HgCl2), D.W

③ Gower's solution : Sod. sulfate, Glacial acetic acid, D.W

④ 희석 pipette에 0.5눈금까지 혈액 흡입하고 101까지 희석액을 흡입 → 200:1 희석

cf> 빈혈이 심할 경우 100 : 1로 희석한다.

⑤ 계산 : R × 25/5 × 10 × 200 = R × 10000 = 1mm3

* 계산 후 20개 이상 차이시 다시 조작.(×400검경)

⑥ 정상치 : 남자 450~500만개/mm3, 여자 400~450만개/mm3

9. WBC count : 적혈구를 용혈시켜야 한다.

① 2% acetic acid, 1% Hydrochloric acid(0.1N HCl)

② Turk's solution : Glacial acetic acid(적혈구 파괴 시약), Gentian violet CWB(염색), D.W(희석효과)

③ 희석 파이펫에 0.5눈금까지 혈액 흡입. 11까지 희석액 흡입 (20:1 희석)

④ 계산 : W × 10 × 20 × 1/4 = W × 50 = 1mm3(㎕)

* 계산 후 12개 이상 차이시 다시 조작(×100검경)

⑤ 정상치 : 성인 4000~10000/mm3, 어린이 9000~40000개/mm3

cf> 희석 pipette - 혈구 희석 또는 일정량(20㎕)의 혈액채취를 목적으로 만들어진 pipette

파이펫 세척 방법 : D.W → Alcohol → Ether(Acetone)

⑥ 유핵 적혈구에 대한 보정

100

Corrected WBCs = uncorrected WBCs × ---------------------------

100WBCs + nRBCs

http://m.cafe.daum.net/laboratoryseouhealth/Tk3L/15?listURI=%2Flaboratoryseouhealth%2F_rec%3FboardType%3DM