세균의 형태
1. 편모(flagella) : Leifson 염색
(1) 무편모성 : Shigella, Klebsiella, Bacillus anthracis, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Haemophilus, Yersinia pestis, Bordetella, Neisseria, Rickettsia
(2) 단모성(monotrichous) : Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Legionella
(3) 쌍모성(amphitrichous) : 나선균(Treponema, Borrelia, Leptospira), Campylobacter, Spirillum
■ 나선균은 특히 축사(axial filament)의 형태로 원형질막 외변부인 periplasm에 위치한다.
(4) 총모성(lophotrichous) : Pseudomonas, Helicobacter
(5) 주모성(peritrichous) : Listeria, Bacillus, Salmonella, Proteus, Escherichia, Citrobacter, Yersinia, Enterobacter, Erwinia, Serratia
2. 협막
(1) 성분 : 다당체 - 점액층이 발달되어서 된 두터운 막모양의 구조체
(2) 항원 : K 항원
(3) 염색 : Hiss 염색(Hiss stain, 균체-자색, 협막-청색), 인디아 잉크(india ink, 균체¶U협막-흰색, 배경-검은색)
(4) 균종 : 협막을 가진 균은 병원성이 강하다(탐식 억제).
- Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, K. pneumoniae, Bordetella pertussis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans
3. 아포(spore)
(1) 100℃ 가열로 사멸되지 않고 간헐멸균법, 고압증기멸균법으로 사멸
(2) 염색
1) Moller 염색(균체-청색, 아포-적색)
2) Schaeffer-Fulton 염색(균체-홍적색, 아포-청록색)
3) Dorner 염색(배경-회색, 아포-적색)
(3) 균종 : Bacillus anthracis, B. cereus, B. subtilis, Clostridium tetani, C. perfringens, C. botulium
II. 세균의 증식 환경
1. 온도
(1) 저온세균 : 12~18℃, 해저, 물속의 세균
(2) 중온세균 : 30~37℃, 병원성 세균
(3) 고온세균 : 55~60℃, 온천수에 사는 세균
(4) 냉장보관 : 4℃
2. 수소이온 농도
(1) pH 5.0~6.0 : Lactobacillus, Mycobacterium, Yeast, Fungi
(2) pH 6.9±0.05 : Legionella
(3) pH 7.0~7.6 : 대부분의 병원성 세균
(4) pH 7.6~8.2 : Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus
3. 산소
(1) 편성호기성균(obligatory aerobes) : 산소가 절대적으로 필요
예 : Pseudomonas, Bacillus, Mycobacterium
(2) 미호기성균(microaerophiles) : 미량의 산소 상태(2~10%)에서 발육
예 : Campylobacter, Brucella, Neisseria, Lactobacillus
(3) 통성혐기성균(aerobic & facultative anaerobes) : 산소와 관계없이 발육
예 : Staphylococcus, Enterobacteriaceae, 장내세균
(4) 편성혐기성균(obligatory anaerobes) : 산소 상태에서 발육이 안 된다.
예 : Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus
4. 이산화탄소
병원성 세균의 대부분이 5~10%의 CO2가 존재할 때 발육 촉진
예 : Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Brucella abortus, Haemophilus influenzae, Streptococcus sp., Corynebacterium diphtheriae
5. 산화, 환원(Eh, rH)
(1) rH 12 이상 : 호기성균 발육
(2) rH 10~12 : 미호기성균 발육
(3) rH 7.4 이하 : 편성혐기성균 발육
III. 멸균과 소독
▶ 정의
● 멸균(sterilization) : 유해성 유무에 관계없이 모든 미생물, 포자와 바이러스들을 사멸(무균 상태)
● 소독(disinfection) : 미생물을 살균시키거나 성장을 억제시켜 감염력과 증식력을 없애는 조작
1. 가압멸균
121℃, 15기압, 15분간 고압증기멸균
(1) 혈액 한천배지(BAP)를 제조할 경우 : 가압멸균(autoclave sterilization) 이후 47~50℃로 식혀서 혈액 첨가
(2) 선택성이 높은 선택배지는 고압증기멸균을 시행하지 않아도 무관하다.
→ BS, SS, TCBS, HE, XLD, 요소 한천배지(urea agar), 아셀렌산염 액체배지(selenite broth), 테트라티오네이트 한천배지(tetrathionate agar)
(3) 당분해배지, BTB 유당 한천배지, SDA, 초콜릿 한천배지(chocolate agar), Müeller-Hinton 한천, 티오글리콜레이트(thioglycollate), 데스옥시콜레이트(desoxycholate)
2. 건열멸균(dry sterilization)
180℃, 2~4시간, dry oven 이용
3. 여과멸균(filtration)
열에 의하여 응고되거나 파괴되는 물질, 즉 항생제, 탄수화물, 체액 및 요소 등의 멸균에 이용(바이러스는 통과함), 미세 filter 이용
4. 응고멸균
85~90℃ 1시간 응고멸균(coagulation sterilization). 계란, 혈청이 첨가된 결핵균배지(Ogawa egg, Lowenstein-Jensen egg), 디프테리아 Löeffler 혈청배지 등 이용
5. 자외선멸균(nonionizing radiation)
2,800~2,900Å 파장의 자외선을 이용
IV. 배지
1. 물리적 성상에 따른 분류
(1) 액체배지 : 세균을 증균시키는 데 사용
(2) 고형배지 : 한천을 첨가하여 고형화한 배지로서, 세균을 분리배양하거나 증식시키는 데 사용
1) 평판배지 : 대부분의 세균 분리, 선택배지
2) 고층배지 : SIM, MIO, O-F 배지, CTA, 운동성 검사 등
3) 사면배지 : Simmon 구연산염 한천배지(citrate agar), 요소 한천배지(urea agar), 페닐알라닌 한천배지(phenylalanine agar)
4) 반사면배지 : KIA, TSI, LIA
(3) 반고체배지 : 0.3~0.5% 한천배지, 운동성, CTA, O-F 배지 운동성 검사에 사용
■ 배지의 한천(agar) 함량
● 5% 한천 : Proteus 균종의 유주(swarming)현상 억제
● 1.5% 한천 : 분리배양에 이용
● 0.3~0.5% 한천 : 반고체배지로서 운동성 관찰에 이용
● 0.05~0.075% 한천 : 티오글리콜레이트 배양액(thioglycollate broth)에 들어 있으며 산화 방지
2. 사용 목적에 따른 분류
(1) 수송배지 : 혐기성 상태로 유지하며 검체 수송 등에 이용
(2) 증균배지 : 어떤 세균종만을 증식시키기 위해 선택성 있는 물질을 첨가한 배지로, 한 가지 종류의 세균만 증식시키기 위해 선택성 있는 물질을 첨가하기도 한다.
(3) 선택배지 : 기본배지에 염료, 담즙, 화학물질, 항생제 등을 넣어서 원하는 균만 증식
(4) 감별배지 : 어느 세균이 배지 속의 어떤 특정 성분을 이용하여 증식하는지 감별하는 데 사용
(5) 분리배지 : 2종 이상의 균이 섞여 있는 경우 어느 한 종만을 분리해 내는 배지
(6) 확인배지 : 미생물의 생화학적¶U물리적 성상을 확인하는 배지(KIA, TSI, LIA 등)
3. 배지와 지시약
V. 염색
▶ 특성
● 단일염색(simple stain) : 한 염료만 사용
예 : 메틸렌블루(methylene blue), 크리스털 바이올렛(crystal violet)
● 감별염색(differential stain) : 두 염료 사용
예 : 그람염색(gram stain), AFB 염색
● 특수염색(special stain) : 특수 구조만 관찰
예 : 협막염색(capsule stain), 편모염색(flagella stain), 포자염색(spore stain)
1. 그람염색(gram stain)
(1) 방법
1) 크리스털 바이올렛으로 1분 동안 모든 균체 염색, 수세
2) 그람 요오드(Lugol sol.)로 1분 매염, 수세
3) 50% 아세톤 알코올(acetone alcohol)로 30초 탈색, 수세 : 그람음성균은 탈색된다.
4) 사프라닌 O(safranin O)로 30초 후염색, 수세, 검경
(2) 결과
1) 양성 : 청자색(violet) → 크리스털 바이올렛에 의한 염색
2) 음성 : 적색(red) → 알코올에 의해 크리스털 바이올렛이 탈색되고 사프라닌 O에 의해 대조염색이 된다.
2. AFB 염색(acid fast bacilli stain)
(1) 종류
1) Ziehl-Neelsen법 : 항산균 세포벽의 왁스(wax)성분을 가열하여 염색을 침투시킨다.
2) Kinyoun 카르볼 푹신 변법(carbol fuchsin) : 가열 대신 계면활성제 사용
3) 형광염색법 : 로다민 오러민(rhodamine auramine), 아크리딘 오렌지(acridine orange, 균체 : 노란색, 배경 : 녹색)
(2) 방법(Ziehl-Neelsen법)
1) 카르볼 푹신(carbol fuchsin = basic fuchsin + phenol)으로 김이 날 정도로 가온염색, 수세
2) 3% 애시드 알코올(acid alcohol)로 30초 탈색, 수세
3) 메틸렌블루로 1분 대조염색, 수세, 검경
(3) 결과
1) AFB(acid fast bacilli) : 적색 → 카르볼 푹신에 의한 균체 염색(항산성균)
2) 배경 : 청색 → 메틸렌블루에 의한 배경 염색
3) 항산성균 : Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia(약산성균), Rhodococcus(약산성균)
3. 이염색소체 염색(metachromatic granule stain)
(1) 종류
1) Albert 염색 : 톨루이딘블루(toluidine blue, 이염색소체를 염색), 말라카이트그린(malachite green, 세포질을 염색)
2) Neisser 염색 : 메틸렌블루, 크리스털 바이올렛(이염색소체 - 청색)
3) 메틸렌블루 단일염색
2) 결과(Albert 염색)
1) 이염색소체 : 진청색
2) 균체 : 연녹색
3) 양성균 : Corynebacterium diphtheriae
4. 협막염색(capsule stain)
(1) 종류
1) Hiss법 : 1% 크리스털 바이올렛, 20% 황산구리(copper sulfate)
2) 먹물(묵즙)법 : 인디아 잉크(india ink)
(2) 결과(Hiss법)
1) 협막 : 연한 청색
2) 균체 : 진한 자색
3) 양성균 : Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans
5. 포자염색(spore stain)
(1) 종류 및 결과
1) Möller법 : 아포 - 적색, 균체 - 청색
2) Dorner법 : 아포 - 적색, 배경 - 회색
3) Abbott법 : 아포 - 청색, 균체 - 분홍색
4) Wirtz-Conkin법 : 아포 - 녹색, 균체 - 적색
6. 편모염색(flagella stain)
(1) 종류 : 레이프손 염색(Leifson stain), 은도말 염색(silver-plating stain), 그레이 염색(gray stain)
(2) 결과 : 흑색
7. 진균염색(fungi stain)
(1) LPCB(lactophenol cotton blue)
(2) 인디아 잉크(india ink)
(3) PAS, GMS
(4) 10% KOH
(5) 그람(+)으로 염색
8. 바이러스, 클라미디아, 리케차 염색
Giemsa 염색, Macchiavello 염색, Wright 염색
9. 무염색 표본의 현미경 검사
(1) 암시야법 : Spirochaetaceae(Treponema, Leptospira, Borrelia) 등은 도은 염색
(2) 식염수 표본 : 운동성 검사
(3) 현적 표본(hanging-drop) : 운동성 검사
(4) 수산화칼륨[potassium hydroxide(KOH) 10%] : 진균
(5) 묵즙 검경(india ink) : 협막 검사
(6) 협막팽화(Neufeld-Quelling) 시험 : 협막 세균
(7) 요오드 표본 : 장관 속 기생충인 선충류, 충난, 원충 포낭(cyst) 등의 검사
VI. 생화학적 성상 검사
1. 탄수화물 분해 시험
(1) 당분해능
1) 페놀레드 배양액 기초배지(phenol red broth)
① 결과 : 산 생성 - 황색, 가스 생성 - 기포 발생
② 지시약 : 페놀레드(phenol red)
2) CTA(cystine trypticase agar)
● 발육 조건이 까다로운 세균의 당분해능 시험에 사용(임균, 수막염균, 연쇄구균 등)
● 한천 0.25%, 페놀레드, 혈청(serum), 당 1%
3) GAM 반유동배지(Gifu anaerobic medium)
① 혐기성균 당분해 시험에 이용
② 한천 0.25%, 당 1%
③ 지시약 없음(균배양 후 당분해 유무에 따라 메틸레드, BTB).
4) O-F 시험배지(Oxidation-Fermentation media)
① 포도당 비발효 그람음성간균 동정(그림 1.3)
② 산화 : 황색(호기성 상태에서 분해)
③ 발효 : 미네랄 오일(mineral oil) 시험관과 공기와 접하는 시험관 모두 황색(혐기성 상태에서 분해)
5) 전분 분해 시험(starch hydrolysis test)
① Corynebacterium diphtheriae Gravis 형의 선별(screening) 시험에 이용
② 전분 0.2% 첨가 배지 ®A 균을 접종, 배양 후 요오드(Lugol iodine) 용액을 떨어뜨린다.
③ 청색 : 전분 있음 - 전분 가수분해능 음성
④ 갈색 : 전분 없음 - 전분 가수분해능 양성
6) 에스큘린 가수분해 시험(esculin hydrolysis test)
① 혐기성균, 연쇄구균 동정에 이용
② 1% 구연산 제2철 암모늄염(ferric ammonium citrate) 수용액
③ 양성(흑색) : Enterococcus faecalis, Bacteroides fragilis
(2) ONPG(O-nitrophenol-b-D-galactopyranoside)
1) 유당(lactose) 분해 음성균 중에서 b-갈락토시다아제(b-galactosidase)를 생성하여 유당을 서서히 분해하는지를 알아보는 시험
2) 양성(황색) : E. coli, Citrobacter, Arizona, Klebsiella, Yersinia, Enterobacter
3) 음성(백색) : Salmonella
(3) 메틸레드(methyl red, M-R)
1) MR-VP 배지 접종, 37℃ 배양 → 포도당(dextrose, 당분해능 부산물) → 메틸레드 적하
[그림 1.4(a)]
2) 적색 : 당분해 양성 강산(pH 5.0)에서 적색
3) 황색 : 당분해 음성
4) 양성균 : E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Morganella, Citrobacter
(4) V-P(Voges-Proskauer)
1) 0.3% 크레아틴(creatine)과 5% a-나프톨(a-naphtol)을 넣어 산화되면 디아세틸메틸(diacetylmethyl)이 되고 크레아틴 축합반응을 일으켜 아세토인(acetoin) 생성[그림 1.4(b)]
2) 당분해 결과 피루브산(pyruvic acid) 형성 : 적색
3) 양성균 : Klebsiella, Enterobacter, Serratia
■ M-R 시험과 V-P 시험이 동시에 양성인 경우는 없지만 동시에 음성인 경우는 있다.
2. 아미노산 분해 시험
(1) 인돌(indole)
1) 트립토판(tryptophan)이 풍부하게 함유된 배지(indole broth, SIM, MIO)에서 트립토판분해효소(tryptophanase)를 가진 균은 트립토판을 탈아미노 가수분해하여 인돌 생성(그림 1.5)
2) Ehrlich, Kovac 시약을 첨가한 후 적색, 적갈색(양성), 황색(음성)
3) 양성 : Escherichia, Proteus vulgaris(P. mirabilis 음성), Providencia alcalifaciens, Shigella sonnei, Vibrio cholerae, Klesiella oxytoca
(2) PPA 반응(IPA) - 탈아미노 반응
1) PPA(phenyl pyruvic acid) : 페닐알라닌 한천(PAD 사면배지)에 균을 접종, 배양한 후 10% 염화 제2철(ferric chloride)을 적하하여 녹색이면 양성(그림 1.6)
2) IPA(indole pyruvic acid) : SIM 배지 중의 철과 결합하여 배지 표층부가 갈색이면 양성
3) 양성 : Proteus, Providencia, Morganella morganii
(3) 리신(lysine), 오르니틴(ornithine), 아르기닌(arginine) 탈탄산 시험
1) 아미노산으로부터 카르복실기(-COOH)를 떼어 내는 탈탄산효소(decarboxylase)의 유무를 알아보는 시험(그림 1.7)
2) 양성 : 자주색 → 노란색 → 자주색 : 탈탄산효소 존재
3) 음성 : 자주색 → 노란색
(4) H2S 생성 시험
1) 세균이 발육하면서 KIA, TSI, LIA, SIM 배지에 들어 있는 티오황산나트륨(sodium thiosulfate), 아황산나트륨(sodium sulfite)을 분해하여 황화수소(hydrogen sulfide, H2S, 흑색) 발생
2) 양성균 : Salmonella, Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Arizona
(5) 요소분해효소 시험
1) 세균이 요소(urea)를 분해하는 요소분해효소(urease)의 생성 여부를 알아보는 시험(그림 1.8)
2) 지시약 : 페놀레드
3) 요소분해효소 양성균 : Morganella, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter, H. pylori, Yersinia enterocolitica, Proteus, Cryptococcus neoformans(병원성 진균)
3. 호흡효소에 관한 시험
(1) 산화효소 시험 : 포도당 비발효 그람음성간균 초기 동정에 이용
1) Neisseria 속에 이용되는 옥시다아제(oxidase) 시험
1% r-aminodimethylaniline oxalate 적하 → 분홍색 → 암자색 → 흑색(양성)
2) 그람음성간균에 이용되는 산화효소 시험 : Kovac 법
1% tetramethyl-para phenylenediamine dihydrochloride 적하 → 암자색(양성)
3) 양성균 : Moraxella, Vibrio, Pseudomonas, Campylobacter, Neisseria, Aeromonas, Bordetella pertussis, Brucella, Flavobacterium
(2) 카탈라아제(catalase) 시험
1) 3% H2O2에서 산소가 발생하여 기포 발생(양성, 그림 1.9)
2) Staphylococcus(카탈라아제 +)와 Streptococcus(카탈라아제 -)의 구별에 검사
3) 항산성균 동정 : 내열성 카탈라아제 시험(30% H2O2)
4) 위양성 : 혈액, 농(pus), 백금이
5) 양성균 : Staphylococcus, Acinetobacter, Haemophilus, Pasteurella multocida, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Neisseria
(3) 시안화칼륨(potassium cyanide, KCN)
1) 호흡효소의 작용을 저해하는 KCN의 일정 농도에서 균이 발육되는가의 여부 확인
2) 발육 양성(turbidity) : Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas
3) 발육 음성(clear) : E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia
4. 균체 외 효소의 생성 시험
(1) 응고효소(coagulase) 시험
1) 사람, 토끼의 혈장(fibrinogen) + 균 → 혈장 응고[피브리노겐(fibrinogen → 피브린(fibrin)]
2) 양성균 : S. aureus
(2) 젤라틴(gelatin) 액화 시험
1) 4℃, 30분 동안 냉장보관 시 응고되지 않고 액체로 남아 있다면 양성(그림 1.10)
2) 양성균 : S. aureus, Proteus, P. aeruginosa, Bacteroides
(3) DNase 시험
1) DNase 배지를 사용하여 DNase의 생성 여부를 알아보는 시험
2) 양성균 : S. aureus, Serratia marcescens
(4) 레시토비텔린[lecithovitellin, 난황 한천배지(Egg-Yolk agar)]
1) 난황 중에 포함된 지질단백(lecithin)을 분해하여 집락 주변이 희게 혼탁되는 반응
2) 양성균 : Clostridium perfringens, B. cereus, P. aeruginosa
(5) PPNG(penicillinase producing Neisseria gonorrhoeae) 시험
1) b-락타마아제(b-lactamase)를 생성하여 페니실린(penicillin)을 가수분해함으로써 항균작용을 불활성화시키는 임균을 검사하는 시험
2) 기타 b-락타마아제 생성 균주 : Serratia, Proteus vulgaris, Haemophilus ducreyi
5. 용혈성 시험
(1) BAP 용혈능 시험
1) a-용혈(a-hemolysis) : 적혈구의 불완전 용혈로 생성된 담록소(biliverdin)에 의한 녹색환이 생긴다. S. pneumoniae (a, b-2중 용혈의 예 : Clostridium perfringens)
2) b-용혈(b-hemolysis) : 적혈구의 완전용혈로 집락 주위가 투명해진다.
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes
3) g-용혈(g-hemolysis) : Enterococcus faecalis
(2) CAMP 시험
B군 용혈성 연쇄구균(Streptococcus agalactiae)은 CAMP(Christie, Atkins, Munch, Peterson) 인자를 생성하여 포도상구균의 용혈을 증강시킨다.
(3) 카나가와 현상(神奈川, Kanagawa phenomenon)
해수, 어류, 패류에서 분리배양된 장염 비브리오균(V. parahaemolyticus)은 Wagatsuma 혈액한천배지에서 용혈이 없지만 오염된 어패류를 사람이 생식하여 감염되어 인체에서 분리배양된 균이 Wagatsuma 혈액한천배지에서 발육 시 적혈구를 용혈하는 현상(사람과 토끼의 적혈구는 용혈하고 말의 적혈구는 용혈하지 못하면 장염 비브리오균임)
6. 색소 생성능 시험
(1) 황색 색소 : S. aureus, Chryseobacterium(Flavobacterium) meningosepticum
(2) 녹색 색소 : Pseudomonas aeruginosa(pyocyanin)
(3) 적색 색소 : Serratia marcescens(prodigiosin)
(4) 자주색 색소 : Chromobacterium violaceum(pyorubin)
(5) 갈색 색소 : F-G 배지에서 Legionella 속의 색소 검사(pyomelanin)
7. 유기산염 이용 시험
(1) 구연산염(citrate) 이용능
1) Simmon 구연산 사면 한천배지(citrate slant agar)의 구연산나트륨(sodium citrate)을 이용하는지를 알아보는 시험
2) 양성(blue) : Enterobacter, Serratia, Salmonella, K. pneumoniae
(2) 말론산(malonate) 이용능
1) 말론산나트륨(sodium malonate)을 탄소원으로 이용하는지를 알아보는 시험
2) 양성(blue) : Klebsiella, Enterobacter
8. 질산염 환원 시험
인산완충액(phosphate buffer, pH 7)에 들어 있는 NaNO3에 균주를 부유시켜 배양한 후 질산염(nitrate)을 아질산염(nitrite)으로 환원했는지의 여부 검사, 장내세균(그림 1.11)
9. 균체 외층의 구조 기능에 관한 시험
(1) 담즙 용해(bile solubility) 시험
1) S. pneumoniae는 담즙에 용균, 확인동정 가능
2) 데스옥시콜레이트 나트륨(sodium desoxycholate) 존재 하에서 용균반응 촉진
(2) 내염성 시험과 호염성 시험
1) 내염성 시험
① 6.5% NaCl 펩톤 액체배지(peptone broth) 발육능(Enterococcus faecalis)
② 7.5% NaCl 펩톤 액체배지(S. aureus)
2) 호염성 시험 : 3%, 5%, 7%에서 발육능을 이용한 Vibrio 균종 동정
(3) 운동성 시험
반유동배지(SIM, MIO), 현적표본(hanging drop), 편모염색(leifson stain)으로 운동성을 알 수 있다.
(4) 열저항 시험과 온도에 의한 발육 유무
1) 80℃ 30분 가온 후 배양 시 발육 : Clostridium tetani, C. perfringens
2) 60℃ 30분 가온 후 배양 시 발육 : E. faecalis
3) 42℃ 부란기 배양 시 발육 : Campylobacter jejuni, Pseudomonas aeruginosa
4) 4℃ 냉장고 1주 발육 : Yersinia enterocolitica, P. fluorescens
5) 저온에 약한 미생물 : Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis - 냉장보관 시 사멸
(5) 알칼리성 액체배지(alkaline broth) 발육
1) V. cholerae : pH 8.4 펩톤 액체배지에 발육
2) E. faecalis : pH 9.6 펩톤 액체배지에 발육
10. 그 밖의 성상
(1) 트윈-80 가수분해 시험(tween 80) : 항산성균 동정 시 트윈-80을 가수분해하여 적색이면 양성
(2) 글루쿠론산 산화 시험(glucuronic acid) : P. aeruginosa 동정
■ 방법 : 베네딕트(benedict) 시약 적하 후 반응 → 청색 → 녹색 → 황색
(3) 바시트라신 A 디스크 감수성 시험(bacitracin A disk) : A군 b-용혈 연쇄구균의 동정
(4) 옵토친 감수성 시험(optochin) : 폐렴구균(S. pneumoniae)의 선별 시험(screening test)
(5) 니아신 시험(niacin) : 인형결핵균(M. tuberculosis)
(6) 3% KOH 시험 : 그람양성¶U음성균의 구별
(7) 마뇨산나트륨 가수분해 시험(sodium hippurate) : B군 b-용혈 연쇄구균의 동정, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes
(8) 노보비오신 내성 검사(novobiocin) : Staphylococcus saprophyticus의 동정
VII. 검체별 미생물 검사
1. 혈액(blood)
(1) 목적 : 패혈증, 균혈증 등으로 고열이 있으면 혈액배양 후 원인균을 검출, 동정 및 항균제 감수성 시험을 실시해서 그 결과에 기초하여 치료를 위한 항균제 선택
(2) 검체 채취 : 발열 직전 채취, 약 30분 간격으로 혐기배양과 호기배양 각각 5ml씩 3회 채혈
(3) 검사 : 배양, 검경, 생화학적 동정
(4) 배지
1) 호기성 : 트립티케이스 대두 액체배지(trypticase soy broth), 뇌심장 조직 주입 액체배지(brain heart infusion broth)
2) 혐기성 : 티오글리콜레이트 액체배지(thioglycollate broth)
3) 첨가 항응고제 : SPS(sodium polyanethanol sulfonate), PAPA(r-aminobenzoic acid)
(5) 배양 방법
1) 배지 : 혈액 = 10(50ml) : 1(5ml)
2) 35℃ 배양기(incubator)에서 8~12시간 배양
3) 발육 양상 : 용혈, 가스 생성, 세균 덩어리 형성, 혼탁 등의 발육 양상 변화를 보이면 맹계대배양(blind subculture) 실시
4) 맹계대배양 : 혈액한천배지(blood agar), 초콜릿 한천배지, MacConkey 한천배지에 CO2 5~10%에서 12~24시간 배양
(6) 혈액배양에서 검출되지 않는 균
N. gonorrhoeae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Clostridium tetani, Shigella
2. 중추신경계(뇌척수액)
(1) 목적 : 급성 세균성 수막염, 결핵성¶U바이러스성 수막염
(2) 검사 : 육안적 관찰(붉은색 - 뇌출혈, 혼탁 - 결핵성 뇌막염), 검경(묵즙표본검사, 그람염색, 항원검사), 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 원심침전액의 배양
(3) 검체 채취 : 뇌척수액
1) 1번 시험관 : 세포수 계산, 세균감별 염색
2) 2번 시험관 : 상등액으로 화학검사
3) 3번 시험관 : 그람염색, 세포학적(cytology) 검사, 배양
(4) 배지 : 혈액한천배지, 초콜릿 한천배지 또는 NAD와 V 인자를 첨가한 배지에 배양 실시
(5) 흔히 분리되는 균 : S. pneumoniae(성인), N. meningitidis, H. influenzae, 혐기성 Bacteroides sp., Cryptococcus neoformans
3. 호흡기계[객담(sputum)]
(1) 상기도계
1) 목적 : 여러 종류의 세균이 상재하고 있으며, 급성 인두염, 디프테리아, 백일해균 진단이 목적
2) 검체 채취 : 인두, 후두, 비강 등의 상기도에서 검체 채취
3) 검사
① b-용혈성(b-hemolytic) Streptococci A군에 의한 인두염 : 바시트라신 A 디스크 검사
② Corynebacterium diphtheriae에 의한 디프테리아 : Löeffler 혈청배지 배양
③ Bordetella pertussis에 의한 백일해 : Bordet-Gengou 한천 배양
(2) 하기도계
1) 목적 : 하기도계에는 상재균이 없으며, 주로 결핵균 진단이 목적
2) 검체 채취 : 이른 아침 기상 공복 시 양치질 후 객담 채취(세포 군집이 관찰되면 올바른 검체를 채취했음을 증명)
3) 검사 : 검경(AFB 염색), 배양(37℃에서 6~8주, 3~5% CO2)
4) 검체 전처리
① 4% NaOH 또는 KOH, NALC 사용
② 결핵균(TB) 외의 잡균 제거와 객담 소화작용
5) 배지 : Ogawa 배지, Lowenstein-Jensen 배지, Middle brook 7H10 배지
6) 흔히 분리되는 균 : Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis
4. 요로계[요(urine)]
(1) 목적 : 세균뇨(bacturia)와 요도에서의 오염 구별
(2) 검체 채취 : 아침 첫 요 중 중간 요를 채취하되 검사가 지연될 경우 4℃ 냉장보관
(3) 정량배양
1) 지름 2mm의 정량 루프(loop)를 사용(0.01ml)해서 중앙에 1차 접종 후 획선배양
2) 결과
① 집락(colony) 105개/요(urine) ml(= 1,000개/plate) 이상 : 세균뇨 의심
② 103개/요 ml 이하 : 정상 요
(4) 배지 : 혈액한천배지(그람양성균 발육), MacConkey 한천배지(그람음성균 발육) 이용
(5) 감염 요에서 흔히 분리되는 균 : E. coli, Klebsiella, Enterococcus, Pseudomonas, N. gonorrhoeae, M. tuberculosis, Proteus, Salmonella, Leptospira, 대장균형(Coliform) bacilli
5. 위장계[대변(stool)]
(1) 검체 채취 : 1~2g 채취, 농성 부분, 점액성 혈액이 있는 부분 채취
(2) 검사 : 도말검사(기생충 검색), 배양
(3) 흔히 분리되는 균 : Salmonella 속, Shigella 속, Vibrio 속, 장염 대장균, Clostridium difficile, Yersinia enterocolitica, Aeromonas 속
VIII. 항균제 감수성 검사
▶ 목적
● 감염병 치료에 적합한 항균제를 선택하여 치료에 사용
● 항균제 내성균의 현상 파악
● 페니실린 내성 균주에 대한 b-락타마아제(b-lactamase) 시험을 실시하여 N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. aureus 균에 대한 b-락타마아제 생성 유무 확인
● 균 동정에 응용되는 옵토친 감수성 시험, 바시트라신 감수성 시험, 노보비오신 감수성 시험 실시
● 최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC) : 배양된 세균의 육안적 증식을 억제할 수 있는 가장 낮은 항균제의 농도
1. 디스크 확산법(disk diffusion test), Kirby-Bauer 디스크법
(1) 재료
1) Müeller-Hinton 한천(배지의 두께를 약 4mm로 일정하게 해야 함)
2) 항균제 디스크
3) 표준탁도액, 생리식염수
4) 멸균 면봉, 디스크 디스펜서, 원형 계측용 자(zone reader)
(2) 방법
1) 순수 배양된 집락 4~5개를 증균용 배지에서 3~5시간 증균
2) 배양액을 표준탁도액의 농도와 같도록 멸균된 생리식염수나 액체배지로 희석
3) 멸균된 면봉으로 균 배양액에 적시고 표면이 마른 한천 평판 위에 고루 접종
4) 평판 뚜껑을 닫고 3~5분 동안 방치(배지 표면의 습기가 흡수되어 물기가 없도록)
5) 디스크 디스펜서를 이용하여 디스크를 균이 접종된 배지에 놓고 살짝 눌러 밀착
6) 디스크를 놓은 평판은 즉시 16~18시간 37℃에서 배양(반드시 16~18시간 배양)
(주의 : CO2가 있는 곳에서 배양하면 안 됨)
(3) 판독
1) 원형 계측용 자(zone reader)를 사용하여 디스크 지름(6mm)을 포함한 발육 억제대 지름을 측정한다.
2) 육안으로 보아서 발육이 완전히 억제된 곳을 발육 저지대의 한계선으로 본다.
3) 발육 억제대의 크기가 최소억제농도(MIC)와 상관관계를 가진다.
4) Proteus spp.는 발육억제 부분 위로 퍼져 자란 것(유주현상)은 무시하고 판독한다
2. E-시험
1) E-시험(E-test) 항균제 스트립(strip)
① 폭 5mm, 길이 60mm의 가늘고 긴 플라스틱 스트립(plastic strip)
② 앞면 : 최소억제농도 눈금이 mg/ml 단위로 적혀 있다.
③ 뒷면 : 최저부터 최고까지 항균제 농도가 스트립 뒷면에 건조된 상태로 고정되어 있다.
2) 한천배지에서 자란 각각의 MIC를 정량으로 측정하는 항균제 감수성 시험
3. 액체배지 희석법(broth dilution test)
세균의 성장을 억제하거나 죽이는 데 필요한 항균제의 최소량(MIC)을 결정
(1) 재료
1) Müeller-Hinton 배양액 또는 트립티케이스 대두 액체배지(trypticase soy broth)
2) McFarland No. 0.5 표준탁도액
3) 멸균된 피펫(1ml, 5ml), 각 항균제 희석 농도
(2) 방법
1) 항균제는 용매에 녹여 일정한 농도로 보관한다.
2) 시험관에 Müeller-Hinton 배양액을 0.5ml씩 분주한다.
3) 항균제 용액 1ml를 1번 시험관에 가하여 혼합하고 0.5ml를 뽑아 2번 시험관에 분주¶U혼합, 다시 0.5ml를 뽑아 3번 시험관에 분주¶U혼합하여 9번 시험관까지 항균제가 희석된다.
4) 10번 시험관은 항균제를 넣지 않고 대조군으로 사용한다.
5) 18시간 정도 배양한 시험균을 표준탁도액과 탁도를 맞추고 100배 희석한다. 희석한 부유액을 0.5ml씩 10개의 시험관에 주입한다.
6) 37℃에서 16~20시간 배양 후 균의 증식 유무를 확인한다.
(3) 판독
1) 세균의 증식이 없는 시험관 중에서 항균제가 제일 적게 든 관의 항균제 농도가 MIC(최소억제농도)이다.
2) 증식이 안 된 시험관을 평판배지에 접종하여 배양한다.
3) 18시간 배양 후 증식이 없는 항균제의 최소량을 최저살균농도(Minimal Bacteri-cidal Concentration, MBC)로 결정한다.
4. 한천 희석법(agar dilution test)
원리는 액체배지 희석법과 유사
5. b-락타마아제 시험(b-lactamase test)
N. gonorrhoeae, H. influenzae, S. aureus 중에서 b-락타마아제를 생성하여 페니실린-G(penicillin-G)나 암피실린(ampicillin)에 내성을 나타내는 균종의 확인에 이용하는 시험
■ 참고사항
● 항생제 감수성 검사에 쓰이는 탁도 : McFarland No. 0.5(파란색)
● 탁도(No. 0.5)가 가리키는 세균수 : 1.5×108개/ml
● 디스크 간 간격 : 24mm
● 디스크와 평판배지(plate) 가장자리와의 간격 : 15mm
● 주의 : CO2 배양기에 넣으면 안 된다.
IX. 세균의 기타 특성
1. 독소
표 1.2 참조
2. 유주(swarming)현상
(1) 균종 : Proteus(강함), C. tetani(약함), Pseudomonas aeruginosa
(2) 유주현상 억제제
1) 한천 5~7%
2) 담즙(bile)
3) PEA(phenylethyl alcohol agar)
4) BS, SS 배지
5) 0.1% 아지드나트륨(sodium azide)
6) 데스옥시콜레이트 나트륨(sodium desoxycholate)
7) NaCl 제거
8) 0.1% 염산(chloral hydrate)
3. 색소
(1) Staphylococcus aureus : 황금색
(2) Serratia : 적색(prodigionin)
(3) Pseudomonas : 녹색(pyocyanin), 형광황록색(pyoverdin), 적색(pyorubin), 갈색(pyomelanin) 등의 여러 가지 색소 형성
4. 질환
(1) 성병 원인균 : Neisseria gonorrhoeae(임질), Treponema pallidum(매독, 경성하감), Haemophilus ducreyi(연성하감), Trichomonas vaginalis(원생동물성 질염)
(2) 수막염 원인균 : Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans
(3) 식중독 원인균
1) 감염형 식중독 : Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, E. coli, Yersinia enterocolitica
2) 독소형 식중독 : Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, C. perfringens
7주차- 항균요법.pptx