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Agarose gel은 전기영동에 쓰이는 것으로 DNA가 이동하는 매질의 역할을 한다.

DNA를 고정하는 능력이 우수하여 DNA를 분자량에 따라 분리해내기가 용이하다.

제조 준비

① 1 × TAE Buffer, Ethidium, Agarose

② 전자레인지, 방열장갑, 수평계

제조 과정

1. 제조과정에 쓰일 물품들을 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 닦는다.

2. Buffer를 비커에 넣고 Buffer 무게의 1/100에 해당하는 Agarose를 비커에 넣는다.

→ 이 때 Gel에 들어가는 성분들의 비율은 다음과 같다.

 3. 2의 삼각플라스크를 전자레인지에서 가열한다. 5초 혹은 10초 간격으로(비커 안의 내용물이 끓어 넘치지 않을 정도의 시간) 삼각플라스크를 꺼내서 플라스크를 바닥에 닿게 하여 천천히 돌려주면서 식힌다. 살짝 식으면 다시 집어넣고 내용물이 투명 해 질 때까지 반복한다.

4. 3의 과정이 끝난 플라스크에 Etidium Bromide의 정량을 집어 넣는다. 

5. Gel 주형틀의 수평을 맞추고 Gel을 붙는다. 

6. Kimps등의 실험용 휴지로 위를 덮어서 먼지가 내려앉지 않게 한다.

RNA Tirzol RNA 뽑는다

bacteria 1ml 딴다

bacteria cell down

원심분리 해준다 / 상층액 제거

trizol 500ul 넣고 파이펫팅 (인버팅 20~25회)

200 ul chloroform (1L :200) // 1:5 비율

vortxing or inverting (20~25회)

실온방치 5분

hy speed 4도 (12000rpm, 15min)

상층액 (clear부분만 따준다) // 200ul 파이펫 추천

새로운 튜브를 준비하여 넣어준다

iso prophenol 500ul 넣고 inverting (10~15회)

아이스박스에 넣고 10분 stand (온도 :4도)

원심분리 (12000rpm , 10min)

상층액을 제거해준다 (peper towea 깔고 튜브를 엎어준다)

DEPC 1ml (20ul) 넣어준다

in verting (펠렛을 잘모아주기 위해서)

원심분리 (10000rpm , 5min)

상층액 제거 (새로운 perper towea 깔고 엎어준다)

air – dry 과정해준다 (air-dry 기계를 작동하여 펠렛을 모아주고 4-5번 정도 긁어준다)

air- dry 한 Rna를 공기차단 (실험 플라스크에 넣고 15분 방치)

진공 방치된 Rna를 꺼내어 DEPC (DW) 20ul 넣고 100회 (파이펫팅)해준다

석영 50ul (260nm – 280nm) 실험 시작

1.5ml tube (DEPC 50ul) // RNA (2ul) = 26배 희석 , 블랜크를 제거 시켜준다

260/280 = 1.8 ↑ 이면 잘 뽑힌 것

18ul => gel runing

(2) Phase separationⓐ Incubate the homogenized sample for 5 minutes at room temperature to permit complete dissociation of the necleoprotein complex.

ⓑ Add 500㎕ of chloroform per 1ml of TRIzol reagent used for homogenization. 

☞ chloroform에 의해 층이 분리된다.

ⓒ Cap the tube securely. Shake the tube vigorously by hand for 15 seconds.

ⓓ Incubate for 5 minutes at room temperature.

ⓔ Centrifuge the sample at 12,000 rpm for 15 minutes at 4'C.

Note : The mixture seperate into a lower red phenol chloroform mixture phase, an interphase, and a colorless upper aqueous phase. RNA remains in the aqueous phase. The upper aqueous phase is ~50% of the total volume.

ⓕ Place the aqueous phase into a new tube and proceed to the RNA isolation procedure.

ⓖ save the interphase and orgnic phenol-chloroform phase if isolation of dna or protein is desired. see dna isolation procedure and protein isolation procedure for details. the organic phase can be stored at 4c overnight

(2) 상분리

ⓐ 균질화 된 시료를 실온에서 5 분 동안 배양하여 necleoprotein complex가 완전히 해리되도록한다.

ⓑ 균질화에 사용 된 TRIzol 시약 1ml 당 클로로포름 500㎕를가한다.

☞ 클로로포름과 분리.

ⓒ 튜브를 단단히 고정하십시오. 튜브를 15 초 동안 손으로 힘차게 흔든다.

ⓓ 상온에서 5 분 동안 품어 낸다.

4,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리한다.

노트 : 혼합물은 낮은 적색 페놀 클로로 폼 혼합물 상, 계면 및 무색상의 수 상부층 으로 분리된다.

RNA는 상부층 상에 남아있다. 상부 층의 총 부피의 약 50 %이다.

aqueous 수성 상을 새로운 튜브에 넣고 RNA 분리 절차를 진행하십시오.

dna 또는 단백질의 분리가 필요한 경우 계면 및 유기 페놀 - 클로로포름 상를 저장하십시오. 자세한 내용은 DNA 분리 절차 및 단백질 분리 참조하십시오. 유기상은 밤새 4c에서 저장할 수있다.

(3) RNA isolation procedure

Add 200 μL of isopropanol to the aqueous phase.

☞ The ratio of isopropanol to chloroform is 1: 1.

☞ Through this process, the RNA dissolved in the aqueous layer solidifies.

Ⓑ Incubate at room temperature for 10 minutes, and centrifuge at 12,000 x g for 10 minutes at 4'C.

- Remove supernatant

※ RNA WASH

Ⓒ Remove the supernatant from the tube, leaving only the RNA pellet.

Ⓓ Wash the pellet with 1 ml of 75% ethanol per ml of TRIzol reagent used in homogenization.

☞ After dehydration process, the pellet becomes clearer.

Note: The RNA can be stored in 75% ethanol at least 1 year at -20 ° C, or at least 1 week at 4 ° C.

In relation to time, this process is carried out and kept at -20 ° C refrigerator.

Ⓔ Vortex the sample briefly, then centrifuge the tbe at 7500 x g for 5 minutes at 4'C. Discard the wash.

☞ Completely remove the ethanol. It may interfere with cDNA synthesis.

Ⓕ Air dry the RNA pellet for 5-10 minutes.

Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility.

☞ The pellet is dried and becomes transparent. When it becomes somewhat transparent (completely dry X)

(3) RNA 분리 절차

수성 상에 200 μL의 이소프로판올을 첨가한다.

☞ 클로로포름에 대한 이소프로판올의 비율은 1 : 1

☞이 과정을 통해 수성층에 용해 된 RNA가 고형화된다.

Ⓑ 실온에서 10 분간 배양하고 4 ℃에서 12,000 x g으로 10 분간 원심 분리한다.

- 상층액 제거

※ RNA WASH

Ⓒ 상층 액을 제거하고 RNA pellet만을 남긴다.

hom 균질화에 사용 된 TRIzol 시약 1ml 당 75 % 에탄올 1ml로 펠렛을 씻는다.

☞ 탈수 후 펠릿이 깨끗해진다.

참고 : RNA는 -20 ° C에서 적어도 1 년 또는 4 ° C에서 최소 1 주일 동안 75 % 에탄올에 저장할 수 있습니다.

시간과 관련하여 이 과정을 수행하고 -20 ° C의 냉장고에 보관합니다.

sample 샘플을 짧게 볼 텍싱 한 후 7500 x g에서 5 분 동안 4 ℃에서 원심 분리한다. 세척 물을 버립니다.

☞ 에탄올을 완전히 제거하십시오. 그것은 cDNA 합성을 방해 할 수 있다.

RNA 원심 분리기를 5-10 분 동안 공기 건조

참고 : 펠렛이 용해성을 잃을 수 있기 때문에 RNA가 완전히 마르지 않게하십시오.

☞ 펠릿이 말라서 투명하게됩니다. 그것이 다소 투명 해지면 (완전히 건조한 X)

<7> Agarose gel electrophoresis

● 실험목적

Bacteria로부터 분리한 plasmid DNA를 agarose gel 전기영동을 이용해 확인해 본다.

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● 실험원리

DNA gel 전기영동 방법은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 지니고 있다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지고 gel matrix가 치밀할수록(gel %가 높을수록)늦어지며, 또한 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다.

gel에 홈을 만들어 DNA나 RNA, 단백질 등의 분자를 집어넣고 전류를 흘려주면 음전하를 띤 이들 분자들은 전기적인 힘에 의해 gel안에서 이동하게 된다. 같은 크기를 가진 분자들은 하나의 집단을 형성하여 움직이게 되는데 만약 동일한 분자들을 전기영동 하였다면 겔을 염색하였을 때 이것이 하나의 띠 모양으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들을 나란하게 전기영동 하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적인 위치를 비교함으로써 그 크기를 측정할 수 있다.

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● 실험재료

plasmid DNA, agarose, comb, gel tray, gel 틀, 전기영동장치, 1X TAE buffer,

6X gel loading buffer, 1kb DNA ladder, EtBr solution(25ug/ml), UV lamp

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● 실험방법

1. Agarose gel 만들기

1) agarose 1%(w/v)를 저울로 재어 플라스크에 넣은 후 1X TAE buffer에 넣고 입구를 랩으로 감싸고 구멍을 뚫는다.

2) 플라스크를 전자렌지에 넣어 녹인다.

3) Agarose가 완전히 녹으면 gel tray와 comb를 장착한 틀에 적당량을 붓고 상온에서 굳힌다.

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2. Plasmid DNA loading & 전기영동

1) 전기영동 장치에 1X TAE buffer를 채우고, 만들어 놓은 agarose gel을 넣는다.

2) 6X loading buffer를 DNA sample에 총 부피가 1X가 되도록 pipetting하여 섞어 준 후, agarose gel에 3ul씩 loading 하고, sample의 양옆에는 marker를 3ul씩 loading하여 100V에서 전기영동 한다.

3) 전기영동이 끝나면 장치의 전원을 끄고 gel을 꺼내서 EtBr 용액에 넣고 15분간 염색시킨다.

4) UV lamp로 전기영동이 끝난 gel의 DNA 밴드를 확인한다.

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● 실험결과

1~6조 모두 4개의 밴드가 나왔다

위에서부터 차례대로 open circular, linear DNA, Denaturation Supercoiled DNA, supercoiled DNA순이다.

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● 실험고찰

1. Loading buffer의 역할

loading buffer는 분자량이 큰 글리세롤, 수크로오스 등 무거운 물질이 함유되어 있어 전기영동시 DNA와 같이 혼합하여 gel 속에 잘 가라앉히는 역할을 한다.

또한 Bromophenol blue, Xylene cyanol, Orange G tracking dye를 포함하기 때문에 전기이동하는 동안에 dye의 위치를 육안으로 관찰하여 DNA가 gel상에 전기영동 되는 위치를 추측가능하게 하는 역할도 한다.

출처 : http://blog.naver.com/withcoffee67/70158243055

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2.TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 사용하는 이유

TAE의 Tris는 양이온을 공급하고, Acetate는 pH를 낮추기 위해 사용된다.(pH가 높으면 DNA가 해리된다.)

EDTA는 Mg2+등 2가 이온을 잡아 묶어 킬레이트제 역할을 하여 효소를 불활성화 시킨다.이로인해 전기영동 하는 동안 DNA는 DNase로부터 보호된다.

일반적으로 TBE(Tris-borate-EDTA) 가 TAE(Tris-acetate-EDTA)보다 완충능력이 더 좋아 전기영동을 길게 할 경우 TBE가 더 적합하지만 DNA를 elution할 때는 borate가 방해하기 때문에 TAE를 주로 사용한다.

http://en.wikipedia.org/wiki/TAE_buffer

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3.EtBr staining 원리

EtBr(Ethidium Bromide)는 평면적인 분자구조를 가지고 있는 물질로 자외선을 받아 가시광선으로 파장을 변화시키는 일종의 형광물질로써 푸른빛 계통의 짧은 파장의 빛을 붉은빛 계통의 긴 파장의 빛으로 바꾸어 내보낸다.

254nm파장의 UV가 DNA에 부딪힐 때 302~366nm의 파장으로 반사되는데 이 빛은 EtBr의 흡수 된 후 590nm정도의 가시광선으로 바뀐다.

즉, gel을 EtBr 용액 속에서 staining 하면 EtBr이 DNA 이중나선의 염기 사이에 끼어들어가기 때문에, gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광색이 발광되어 육안으로 확인 할수 있도록 해주는 역할을 한다.

EtBr은 대표적인 발암물질중의 하나로 실험시 주의하여야 한다.

출처 : http://blog.naver.com/withcoffee67/70158243055

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4.Agarose gel 전기영동에서 DNA 이동에 영향을 주는 요인들

1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.

2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.

3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.

4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.

5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.

6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.

7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.

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출처 : http://phy357.egloos.com/v/591611

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5. 아가로스 전기영동 하였을 때 원래 open circular DNA, linear DNA, supercoiled DNA 3개의 밴드가 보여야 되는데 이번 실험에서는 총 4개의 밴드가 보였다. 이는 플라스미드를 alkaline lysis과정으로 뽑았는데 이과정에 의한 높은 pH로 super coiled 형태의 일부분이 denaturation되었기 때문이다. 

2014.10.15

1) 아가로스 겔 전기영동

: PCR로 원하는 부위의 DNA를 얻고 나서 내가 원하는 DNA가 잘 합성이 되었는지 확인과 분석을 통해서 전기영동이라는 실험을 해야 한다.

전기영동( electrophoresis )의 원리 - DNA를 크기에 따라서 분리를 할 수 있는 방법인데, DNA의 골격중에 인산기는 음전하(-)를 가지고 있다. 음전하를 가진 물질은 음전하에서 양전하(+)측으로 이동하게 되어있다. 이런 이치로 마이너스전하를 띤 DNA는 플러스 전극 쪽으로 이동한다. 또한 DNA분자가 겔 (gel)을 통과할 때 분자량이 큰 것일수록 속도가 느려지게 된다. 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도도 달라진다.

▶ 실험방법

1. 아가로스 겔 만들기

​  1X TBE(Tris-borate : 장 시간 전기영동 시) 또는 1X TAE(Tris-acetate : 단 시간 전기영동 시) buffer에 적절한 농도가 될 수 있게 아가로스 가루를 잘 섞는다. 그리고 가열하여 완전히 아가로스를 녹인다. 아가로스가 녹는 것은 눈에 잘 보이지 않으므로 가열 중간 중간 휘젓어서 확인 한다. 가열시 끓음으로 인해서 농도변화가 생기지 않도록 주의 한다.

 아가로스는 굳지 않을 정도로 살짝만 식힌 후 겔 판에 잘 부어준다. 이 때 기포가 생기지 않게 조심히 부어주며, 혹시 생긴 경우 겔이 굳기전에 잘 정돈해준다.

 깨끗이 세척된 comb를 꽂아 시료 점적이 가능한 공간을 만들고 20 ~ 30분 정도 지나 겔이 굳으면 comb를 빼낸다.

2. 전기영동

전기영동조에다가 working solution TAE를 붓는다. 그 후 겔 판에서 겔을 꺼내어 전기 영도조에다가 담군다. comb를 빼낸 홈에 각각의 DNA를 넣는다. DNA샘플은 파이펫을 이용해서 조심히 넣어야 한다. 그리고 전기영동조를 작동시킨다.

 전기 영동의 전류는 gel의 두께와 길이에 반비례하고 관찰하고자 하는 DNA의 크기에 비례하게 걸어준다.

 전류가 너무 낮고 시간이 오래 걸리면 DNA밴드가 번진 것처럼 보이고 너무 놓으면 전기 저항이 높아져 gel온도가 올라가 부분적으로 gel이 녹게 된다.

실험에 사용된 기기들.

주의사항

1) 아가로스 겔 & TAE농도 맞추기.

Q1. 100X TAE 으로 1X TAE 의 100ml을 만드는데 필요한 양은?     (1X TAE와 + 99ml의 물)

Q2. 50X TAE으로 0.5X TAE의 1000ml을 만드는데 필요한 양은?     (10X TAE와 + 990ml의 물)

Q3. 50X TAE으로 0.5X TAE의 2L을 만드는데 필요한 양은?     (20X TAE와 + 1980ml의 물)

Q4. 20X TAE으로 0.5X TAE의 2L을 만드는데 필요한 양은?     (50X TAE와 + 1950ml의 물)

Q5. 40X TAE으로 0.2X TAE의 1500ml을 만드는데 필요한 양은?     (7.5X TAE와 + 1429.5ml의 물)

2) DNA는 눈에 보이지 않기 때문에 염색을 해야하는데 이 때 Et-Br로 염색을 하여 UV등을 비추면 DNA를 눈으로 확인할 수 있다.

3) Et-Br은 발암물질을 지니고 있기 때문에 주의하여야 한다.

4) comb를 겔 판에서 꺼낼 때 Gel이 찢어지지 않도록 조심한다.

분자생물학 (14102946 김동윤) 1학기 실험 보고서.hwp

Title: Plasmid DNA Extraction by QIAprep Spin Miniprep Kit and Electrophoresis

준비물 : 1.5ml tube, DNA marker, Buffer P1,P2,N3,PB,PE,EB,TAE

Loading dye, EtBr, Agarose, QIAprep Spin Miniprep Kit

사용 장비 : Pipette, 전기영동기구 , Microcentrifuge , UV Lamp

Used Bacteria : Plasmid　DNA　Cloned Vector Transformed E.coli (BL21)

Step 1 (Bacteria pDNA Extraction)

01. pellet 1ml bacteria overnight culture by centrifugation at > 5000 rpm for 5 min

at room temperature 15-25＇c and Allow the culture to flow

02. resuspend pelleted bactria cells in 250 μl Buffer P1(lysis buffer) abd transfer to a microcentrifuge tube.

03. add 250μl buffer p2(SDS) and mix thoroughly by inverting the tube 10 times.

until the solution be comes clear Do not allow the lysis reaction to proceed for more than 5 min.

04. add 350μl buffer N3(Acetic acid) and mix immediately and thoroughly by inverting the tube 10 time.

After the previous experiment 1 min standing in room temperature.

05. centrifuge for 10 min at 12,000 rpm in a table-top microcentrifuge.

06. apply the supernatant from step 5 to the Qiaprep spin column by deconting by decanting or pipetting Centrifuge 60s and discard the flow-through

07. wash the QIAprep spin column by adding 500 buffer PB centrifuge for 60s and Should be discarded the flow-through

08. wash the QIAprep spin column by adding 750μl buffer PE. centrifuge for 60s Transfer the QIAprep spin column to the collection tube and Should be discarded the flow-thorough.

09. centrifuge for 1 min to remove residual wash buffer

10. place the QIAprep column in a clean 1.5ml microcentrifuge tube. to elute DNA,

add 500μl buffer EB(10m tris-cl , ph8.5) let it stand for 1 min, and centrifuge for 1 min

Step 2 (Electrophoresis)

01. <Agarose gel production> 200ml TAE Buffer + Agarose 2g Mix Stir well until dissolved -> + EtBr 15ul

02. Mix the pDNA sample and Loading dye in a 1.5ml tube at a 3: 1 magnification (sample 15ul, dye 4ul)

03. dispensing It will harden after about 45 minutes.

03. Fill the electrophoresis buffer with TAE buffer and add agarose gel.

04. Pipet the marker into the prepared sample on agarose gel.

05. Perform electrophoresis for about 20 minutes.

06. After electrophoresis is complete,take out  the gel and check the result with UV lamp.

Step.3 (Experiment result)

01. Overall, the shape of the marker is not accurate, but it shows a fine shape.

02. Markers 3 and 4 have a distinctive shape, which is presumed to be well distributed.

03. Although the pDNA seems to be present, the result of the pDNA that we were trying to confirm

did not perform enough electrophoresis and the marker size could not be measured.

04. Since the sharpness of the marker is low in the agarose gel, it is judged that there is a technical error.

05. I think I need to practice repeatedly because I lack pipetting skills.

Bactria DNA추출 protocoil

0. 50ml에 bacteria

1.  pellet 1-5 ml bacteria overnight culture by centrifugation at > 5000 rpm for 5 min at room temperature 15-25＇c

펠렛에 1-5ml  박테리아를 하룻밤 배양  5000 rpm으로 원심 분리하여  15-25'c 실온에 5분간 방치

1-1 상층액을 겉어낸다.

2. resuspend pelleted bactria cells in 250 μl Buffer O1 abd transfer to a microcentrifuge tube.

250μl 의 세포 독성 세포를 완충액 p1(lysis buffer)  미세 원심 분리 튜브로 옮긴다.

3. add 250μl buffer p2 and mix thoroughly by inverting the tube 4-6 times. until the solution be comes clear Do not allow the lysis reaction to proceed for more than 5 min. if using lyseblue reagent, the solution will turn blue

 250μl  buffer p2(SDS buffer)를 넣고 10번 튜브를 뒤집어 완전히 섞는다. 용액이 깨끗해질 때까지.1분이상 지속하지않는다 용해반응이 생기기떄문에

lyseblue 시약을 사용하면 용액이 파란색으로 변함

4. add 350μl buffer N3 and mix immediately and thoroughly by inverting the tube 4-6 times. if using lyseblue reagent, the solution will turn colorless

350μl 버퍼 N3(초산)을 추가하고 튜브를 10번 뒤집어서 즉시 원심분리 5000rpm/10분 lyseblue 시약을 사용하면 용액이 무색으로 변함 (희석됨)

5. centrifuge for 10 min at 12,000 rpm in a table-top microcentrifuge

1분 실온에 둔다(뚜껑을닫아둔 상태에서) 미세 원심 분리기에서 12,000 rpm으로 10 분간 원심 분리한다.

6. apply the supernatant from step 5 to the Qiaprep spin column by deconting by decanting or pipetting Centrifuge 30-60s and discard the flow-through, or apply vacuum to the manifold to draw the solution through the QIAprep spin column and swithch off the vacuum source

5 단계의 상징액을 바른다. Qiaprep 스핀 컬럼(상층액넣기)에 붓거나 파이펫팅 30-60 초 원심 분리(12000rpm) 후  

진공을 가하여 용액을 흡입 후 QIAprep 스핀 칼럼 및 스위치 끔

7. recommended: wash the QIAprep spin column by adding 500 buffer PB centrifuge for 30-60s and discard the flow-through or apply vaccum to the manifold to draw the solution through the QIAprep spin column and switch off the vacuum source

NOTE: this step is only required when using end strains or other bacterial strains with high nuclease activity or carbohydrate content

QIAprep 스핀 컬럼에 PB버퍼를 500μl넣는다 30-60 초 동안 원심 분리(12000 rpm)하고 진공적용후 QIAprep 스핀 컬럼을 통해 용액을 꺼내고 진공 스위치를 끈다.

참고 :이 단계는 높은 변형률 활성 또는 탄수화물 함량이있는 최종 균주 또는 기타 박테리아 균주를 사용할 때만 필요합니다

8. wash the QIAprep spin column by adding 750μl buffer pecentrifuge for 30-60s and discard the flow-through or apply vacuum to the manifold to draw the solution through the QIAprep spin column, and switch off the vacuum source. Transfer the QIAprep spin column to the collection tube

750μl의 버퍼를 추가하여 QIAprep 스핀 컬럼을 세척한다.30-60 초 동안 원심 분리(12000rpm) 하고 유액을 버리거나 진공을 가하여 QIAprep 스핀 컬럼을 통

해 용액을 꺼내고 진공 원을 끈다. QIAprep 스핀 컬럼을 수집 튜브에 옮긴다.

9.centrifuge for 1 min to remove residual wash buffer

잔류 세척 버퍼를 제거하기 위해 1 분간 원심 분리한다. (빈 tube를 원심분리)

10. place the QIAprep column in a clean 1.5ml microcentrifuge tube. to elute DNA, add 500μl buffer EB(10m tris-cl , ph8.5) or water to the center of the QIAprep spin column, let it stand for 1 min, and centrifuge for 1 min

QIAprep 컬럼을 깨끗한 1.5ml 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. DNA를 용리 시키거나 QIAprep 회전 컬럼의 중앙에 500μl 완충액

EB(10m tris-cl , ph8.5)  또는 물을 넣고 1 분 동안 정치시킨 다음 1 분간 원심 분리한다

11. MEASURE / spectro photometer (UV. 280nm)

측정/ 분광광도계

12.RUNNING GEL (agarnoge 1%)

13. Etbr(발색)

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1. 50ml bactria 배양

2.5000rpm 에서 centrifuze하고 상층액 버린다.

3. 250nl p1 buffer넣는다 (p1=lysis buffer)

4.새로운 1.5μl tube에 옮겨넣는다

5. invertiy 10회 (천천히)

6. p2 buffer 250 μl 넣는다.mix 하고 invertin (5분이하)

7. 350μl buffy N3 (초산) 넣고 mix inverting 10번 (천천히 , 5분이하)

8. 뚜겅을 닫고/ 1분동안 RT(실온) 보관하고 12000rpm centrifuse

9.분리된 상층액을 QIAprep spin coulum에 넣고 centrifuse

10. PE.sol 500μl 넣고 centri 12000/60초 (12000 60초 상층액 버린다 그러면 plasmid dna만 남는다)

11.pe.sol(Etor 성분) 750μl sjgrh 120000 centrifuse 60초

12. 상층액을 버린다

13. 비어있는 tube를 원심분리 (centri 12000 60초) (남아있는 Etor제거 위해)

14. 새로운 1.5ml tube에 옮긴다

15. EB buffer (10m tris -cl , ph 8.5) 500ul 넣는다. 실온에 1분간 방치

16.running gell (arolose/y)

17. Etbr (발색)