IHC (Immunohistochemistry) 실험방법

 

Immunohistochemistry 

 

Deparaffinization

1. xylen100% 담긴 유리용기에 슬라이드 넣고 위아래로 10번씩 움직임

2. 새(new) xylen 100%에서 다시 10번

3. 100%EtOH, 95%EtOH, 85%EtOH, 75%EtOH에서 10번씩

4. 찬물에서 10번, 새 찬물 10번, 새 찬물에 5분간 담그기

 

Antigen retrieval (unmasking)

-> 이 단계는 생략하고 했다가, 결과를 보고 실시 여부 결정

고정하는 동안 methylene bridge가 형성되어 단백질간 교차결합이 발생하므로 이를 실시해줌

 

1. buffer를 넣고 끓이기 ( 95도~100도) - citrate/ sodium citrate solutiion

2. 슬라이드를 넣고 10~40분간 담그기 - 시간은 최적의 사진이 나오는 것으로 조절

3. 상온에서 30분간 식히기 - 슬라이드에서 조직이 떨어지는 것을 막을 수 있음

4. TBS로 washing

 

staining 

1. 물기 제거 후, DAKO pen으로 marking

2. 3% H2O2 block solution을 떨어뜨리고 10분간 반응 (peroxidase blocking, 조직 내 H2O2가 임의적으로 반응하는 것을 막기위함)

3. 종이에 털고, 물에 잠기게 해서 흐르는 물에 5분간 washing

4. blocking 1시간 (ABC kit - normal horse serum/TBS-T5ml에 노란 라벨 한방울)

5. blocking serum 종이 타올로 제거

6. Primary antibody 1시간 처리

7. 항체 다시 수거 후 TBS-T로 washing 5분 (orbital shaker로 아주 약하게 rpm10정도)

8. secondary antibody 30분 처리

9. TBS-T로 washing5분

10. 미리 만든 VECTASTAIN ABC reagent 30분 반응

11. TBS-T 5분 washing

12. DAB solution 으로 원하는 정도로 발색될 때 까지 반응

13. 찬물에 5분간 살짝 흔들며 washing

 

Hematoxylin counter staining

1. hematoxylin 용액 점적 후 1분간 반응

2. 세척수가 무색이 될 때 까지 흐르는 물로 washing

3. acid rinse 용액에 넣고 10번 정도 위아래로 씻음 (선명하게 해줌)

4. 찬물에 10번 담갔다 빼기

 

mounting

출처: http://blog.naver.com/ji1004hye/190346406

[출처] IHC|작성자 완전찐해