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실습 3주차

남서울대학교 임상병리과

14102946 김 동 윤

실습 1. 다음 용액의 제조에 필요한 용질의 양을 구한다.

1) 0.05 % potassium metabisulffite 500ml = (0.05 x 500 = 0.25)

2) 0.25 % light grenn 1000 ml = ( 0.25 x 1000 = 250ml)

3) 3% alcian blue (1% acetic acid에 용해) 500ml = (3% x 500 = 1500 ml x 0.01 = 15ml)

4) 1:100 sliver nitrate 250ml = 1:100 = x : 250 ( 100 x= 250) x= 2.5

실습 2. 다음 용액의 %와 양을 구한다.

5) 1000배 희석한 ammonium hydroxide 7.5ml 는 몇 % 용액인가?

1:1000 = 7.5 : x ( 750=x) (1000배희석 배수 = 750/1000) = 3/4 = 0.75%

6)5% 용액에서 2.5g의 용질이 들어가도록 만들려면 몇 ml 필요한가?

// x= 50ml

7) 200ml 내의 0.2g은 몇 % 용액인가? 0.04%

실습 3. 다음 용액을 제조한다

8) 10% frerric chloride용액을 사용하여 2% 용액 50ml 제조

1:10 = 2 : 50 ( 20x=50) x=25ml

9) 80% alcohol을 사용하여 60% 용액 500ml 제조

(물 20 / 알코올 80) = 80% (500ml = 물 240ml / 알코올 260ml)

10) 20% formalin 100ml를 10% 용액으로 제조 (20:80 = 10: x)

x= 40

실습 4. 다음 용액을 제조한다

11) 1% alcain blue 100ml 현재 염료의 염료농도는 80% 새염료의 농도는 86%

1:100= x :86 // 100x = 86 // x =0.86

12) 0.5% acid fuchsin 250ml ,현재 염료농도는 82% ,새 염료의 농도는 88%

0.5:250 = 1.25g / 1.25:82= x:88 // 82x=110 // x= 10.34

실습 5.각각의 화학물질 1M과 1N 용액 1000 ml를 만드는 필요한 용질의 양을 구한다.

13)Nacl = 58.44 14) Cacl2 = 110.98 15) Caso4 =136.14

16)Caso4 . 2h2o = 170.14 17) h2so4 = 65 18)k2c03=138.21 19) A(OH)3= 74.98

실습 6. 다음용액을 제조하는데 필요한 용질양을 구하여라

20) 0.1N h2so4 200ml = 130 ml

21) 0.5N caO 500ml = 280.4 ml

22) 0.2N KCI 100 ml = 14.91

23) 0.5N AICI3 200 ml = 124.86

실습 7. 다음 미터법과 US 제도를 변환한다

24) 1dg = 0.01mg

25) 1 cm = 10 mm

26) 1 ul = 1000ml

27) 1kg = 2.20459ib

28) 6 in = 6.9128cm

29) 350 mg = 3500g

30) 5 um = 50mm

31) 1mm = 100cm

32) 1ml = 1cc

33) 5 mm = 5.50323in

34) 1km = 1000000mm

실습 8. 다음 온도를 변환한다.

35) -20℃ 화씨로 = - 68℉

36) 4℃ 화씨로 =39.2℉

37) 72℉를 섭씨로 =22.222222℃

38) 20℉를 섭씨로 =-6.666667℃

실습 9. picric acid 포화수용액 1000ml

2:8 = x:1000 /// 8x= 1000 // x = 125ml

실습 10. 현미경의 각 부의 명칭과 관리법에 관하여 기술

1. 고온 , 고습 및 직사광선은 피한다.

2.사용후에는 대물렌즈를 저배율로 돌려 놓습니다.

3. 대안렌즈 및 현미경 전체를 덮을 수 있는 비닐이나 헝겊으로 덮어 먼지가 쌓이지 않도록 합니다.

3. 눈이나 피부(손, 얼굴 등) 렌즈에 닿지 않도록 주의합니다.

4.렌즈전용 세정제를 면봉에 뭍혀 렌즈를 세척하고 렌즈 전용 세정제를 사용하는 것이 좋으나 없을 경우에는 일반 소독용 알코올을 사용합니다.

5. 관찰이 시작되면 현미경의 위치를 옮기지 않는다.

6. 현미경을 옮길때는 한 손으로 다리를 받치고, 다른 한손으로 손잡이를 잡고 옮겨줍니다.

7. 렌즈는 대게 코팅막이 씌워져 있으므로 코팅막이 벗겨질 경우 코팅을 교체합니다.

2017.3월 2주차 실험 보고서

임상병리학과

유 니

실습 1. 담당교수님으로부터 실험실 안전 교육을 받는다.

실습 2. 일반 안전 수칙이란?

- 실험실로부터 대피할 수 있는 통로가 확보되어야 한다.

- 실험 테이블 위에 유독성 물질을 취급할땐 주의를 기울인다.

- 환기불량, 전기 야기될 수 있는 위험요인에 대하여 실험실을 떠나기 전에 반드시 확인한다.

- 선반이나 테이블위의 시약이 넘어지지 않도록 적절한 안전장치(낙하방지가드)를 한다.

- 전기안전수칙을 지켜 누전사고에 대비한다.

- 실험실은 항상 정리 정돈된 상태로 유지하며, 일상점검 및 정기점검을 실시한다.

가. 실험실 안전수칙을 숙지하고 가능한 사고를 미연에 방지하기 위한 대책을 숙지

나. 반드시 실험복을 착용을 하고, 개인보호구(보안경, 보호장갑, 마스크 등)를 착용

다. 실험 시작 전 반드시 일상점검을 생활화 해둔다

라. 유해화학물질, 독성물질, 휘발성 유기용매 등은 반드시 후드 내에서 사용해야 합니다.

​마. 환기, 전기, 수도, 가스 등 위험요인에 대해 실험 시작 전과 퇴실 전에 반드시 확인

바. 사용하는 모든 유해물질의 물질안전보건자료

(Material Safety Data Sheets,MSDS)를 비치하고, 취급 전 반드시 숙지

사. 소화기, 비상샤워기, 구급함 등의 위치를 파악하고 사용법을 반드시 숙지

아. 실험실은 항상 정돈된 상태를 유지하고, 수시로 환기를 시킨다.

실습3. 병리실험실에서 발생할수 있는 생물학적 재해, 화학적 재해란?

☆ 생물학적 재해

위해의료 폐기물

· 조직물류폐기물

· 병리 폐기물

· 손상성 폐기물

· 생물,화학 폐기물

· 혈액오염 폐기물

격리의료 폐기물

☆ 화학적 재해

· 시약을 테이블에 쏟음 (산성 시약)

· 알코올램프로 인한 화재

· 잘못된 파이펫팅으로 인한 피부손상

· 화학약품의 부주의한 실험으로 인한 피부손상

실습4. 사용할 시약, 염료 등에 대한 MSDS 찾기 유해성 및 취급법에 대한 조사

H/E stain

탈파라핀(각각 3분) - 함수(각각 1분) - 수세 (각각 1분)

Harris hematoxylin (10~15분) -수세(1분) - 1%HCL alcohol-4~5회 침적(넣었다 뺐다)

수세(1분) -ammonia water or lithium carbonate-4~5회 침적- 청색화 – 수세(1분) -1% eosin(3분)

탈수 (1분) - 투명(3분)- 봉입

MSDS (물질안전보건자료)

# MSDS(Material Safety Data Sheets)란?

물질안전보건자료(MSDS)란 화학물질 및 화학물질을 함유한 제제(대상화학물질)의 명칭,

구성성분의 명칭 및 함유량, 안전·보건상의 취급주의 사항, 건강유해성 및 물리적 위험성 등을 설명한 자료

# 도입배경

화학물질 취급 근로자에게 유해성·위험성 등에 대한 근로자의 알권리(Workers’ Right-to-Know)

확보 및 화학물질로 인한 산업재해 예방

# 작성항목

1. 화학제품과 회사에 관한 정보

2. 유해성·위험성

3. 구성성분의 명칭 및 함유량

4. 응급조치 요령

5. 폭발·화재 시 대처방법

6. 누출 사고 시 대처방법

7. 취급 및 저장방법

8. 노출방지 및 개인보호구

9. 물리화학적 특성

10. 안정성 및 반응성

11. 독성에 관한 정보

12. 환경에 미치는 영향

13. 폐기시 주의사항

14. 운송에 필요한 정보

*목적:
 항산성균임을 확인하기 위함

*준비물:

auramin-rhodamine

 3% HCl-alcohol

0.5% potassium permanganate

알코올램프, 루프, 검체, 염색대 등

*방법

•  검체를 슬라이드에 도말 고정한다.
  
  
• 슬라이드 위에 auramin-rhodamine를 붓고 약 20분간 염색(균을 염색하는 과정)
  
  
• 수세 후 물기 제거
  
  
• 3% HCl-alcohol로 5~10초간 탈색(양성균은 원리에 의해 탈색이 되지 않지만 음성균은 탈색된다.)
  
  
•  0.5% potassium permanganate로 3분간 처리한다.(과다한 형광물질을 제거하기 위함)
  
  
•  수세 후 공기 중 건조(여기서 절대 흡습지를 사용하지 말것, 종이에는 다량의 형광물질이 함유되어 있어 위양성이 나올 수 있기 때문)
  
  

*결과

양성균은 검은 바탕에 녹황색을 띠지만 음성균은 형광현미경으로 보기 때문에 보이지 않는다.

AFB stain

IMViC test

• Coliform group* 세균 동정에 수행되는 시험들 (Enterobacteriaceae 세균 구분에 유용)
• 4개 실험의 앞글자를 따서 IMViC라고 함
• “I” : Indole test
• “M” : Methyl red test
• “V” : Voges-Proskauer test
• “iC” : Citrate test (in Citrate)

Indole test

• Tryptophanase에 의해 tryptophan이 idole, pyruvate 및 ammonium으로 분해되는 것을 확인하는 실험
• Typtophan이 존재하는 액체 배지에서 미생물을 배양한 후 Kovac’s reagent를 첨가하여 확인 
  (배지 상층부에 분홍색 및 붉은색 층이 형성되면 양성)

Methyl red & Voges-Proskauer test

• MR-VP 배지에서 미생물을 배양한 후 배양액을 두 개의 시험관에 나누어 담은 후 하나의 시험관에는 Methyl red 시험을,
  다른 하나에는 Voges-Proskauer 시험을 수행
• Methyl red 시험 : 미생물이 MR-VP 배지에 존재하는 dextrose를 발효하여 산을 형성하는지를 알아보는 시험,
  배양액에 methyl red를 떨어뜨려 확인 (양성은 붉은색, 음성은 노란색을 띔)
• Voges-Proskauer 시험 : 2,3-butanediol 발효 경로의 중간생성물인 acetylmethylcarbinol (acetoin)의 존재를 알아보는 시험
   (즉, 배양한 미생물이 2,3-butanediol 발효 경로를 지니고 있는지를 확인하는 시험),
  배양액에 alpha-naphthol과 potassium hydroxide를 첨가하여 5-10분 동안 반응 (분홍색 및 붉은색을 형성하면 양성)

Citrate test

• Simmon’s citrate agar 배지에서 미생물을 배양하여 citrate를 탄소원으로 사용하는지를 알아보는 시험
• Citrate (탄소원), ammonium ions (질소원) 및 bromothymol blue (지시약)이 존재하는 배지에서 미생물을 배양
• 미생물을 배양하여 초록색의 배지가 푸른색으로 변하면 양성 (즉, citrate를 탄소원으로 이용하면 배지가 푸른색으로 변함)

출처] IMViC test|작성자 jisung

<그람 염색은 분별 염색 방법이다>

​
단순 염색에 이어서, 그람 염색 (Gram-staining)에 대해 알아보겠습니다. 염색의 근본적인 원리는 단순 염색을 설명하면서 알아보았기에 넘어가도록 하겠습니다. 한 가지 짚어보고 넘어가야 할 것이 있다면, 그람 염색은 분별 염색 (Differential staining) 방법 중 하나라는 것입니다. '분별 - 서로 다른 일이나 사물을 구별하여 가름' 이라는 뜻입니다. 미생물의 식별을 용이하게 하기 위하여 두 가지 이상의 생물학적 염료를 사용하는 방법입니다. 그럼 무엇을 구별하느냐! 바로 그람 양성 (gram-positive)과 그람 음성 (gram-negative)입니다. 미생물 중 bacteria... 즉, 세균의 경우 세포벽의 차이에 따라 그람 양성과 그람 음성으로 구분합니다. 그람 양성과 음성의 세포벽 차이는 아래 그림을 보시면 아실 수 있습니다.

제가 선택배지와 분별배지에 대해 설명할 때 항상 예로 설명하는 배지가 하나 있습니다. 바로 MacConkey agar 배지입니다.

(맥콘키...) MacConkey agar 배지는 선택배지와 분별배지의 목적을 모두 가지고 있는 배지입니다.

MacConkey agar 배지의 조성은 아래와 같습니다.

(※ 제조사마다 조성물은 같으나 함.유.량은 약간 다를 수 있습니다.)

위의 MacConkey agar 배지의 조성 중 빨간색으로 된 조성물들이 선택 및 분별배지의 역할을 하게됩니다.

먼저 Bile salts와 Crystal violet은 gram-positive 미생물의 생장을 저해하기 때문에 gram-negative 미생물만 생장할 수 있으며,

이러한 성질은 선택배지의 역할을 하게 됩니다. Neutral red는 pH indicator이죠

Neutral red는 pH 6.8 ~ 8.0 의 변색 영역을 지니고 있으며 산성이 되면 붉은색을 띄게 됩니다

MacConkey agar 배지에서 생장한 gram-negative 미생물이 lactose를 발효하여 유기산을 생성하게 되면

이로 인해 배지의 pH가 산성으로 변하여 배지가 붉게 변하게 됩니다. 

이를 통해서 lactose를 발효하여 유기산을 생성할 수 있는 미생물과 그렇지 못한 미생물을 구분해줌으로써 분별배지의 역할을 하게 됩니다.

아래의 사진에는 MacConkey agar 배지에 4 종의 균을 접종하여 배양한 결과입니다. 

1, 2, 4 번은 미생물이 성장하였지만 3 번은 성장하지 못했습니다. 선택배지의 역할을 통해 

1, 2, 4 번의 생장한 미생물들은 gram-negative이고, 3번의 미생물은 gram-positive 임을 알 수 있습니다.

또한 생장한 1, 2, 4 번의 미생물들 중, 1, 2번 미생물만 붉게 변하고 4 번의 미생물은 색의 변화가 관찰되지 않았습니다.

분별배지의 역할을 통해 1, 2 번의 미생물은 lactose를 발효하여 유기산을 생성하지만, 4 번의 미생물은 그렇지 못하는 것을 알 수 있습니다.

후에 미생물학을 공부하다 보면 selection과 screening의 개념을 배우실텐데 

selection은 선택배지를, screening은 분별배지를 연관지어 생각하시면 쉽게 이해하실 수 있을 것입니다.

재료 및 성분 (1 L; Trypticase soy agar + blood)

Pancreatic Digest of Casein                 15g

Papaic Digest of Soybean Meal            5g

Sodium Chloride                               5g

Agar                                              15g

Blood                                             50g

실험 준비물은 생략하겠습니다.

500ml 기준으로 작성되었습니다.

1. agar powder 를 7.5g 맞추어줍니다

2. D/W를 500ml 준비합니다.

3. 준비한 agar powder 와 D/W 를 mix 시켜줍니다

(기계 혹은 손으로 녹여주시면되는데 장비가없는경우 전자렌지를 통해 녹여주시면됩니다)

실험 기준으로 20~30초 돌렸으며 2회 시행하였습니다.

4. Autoclave 121도 15분 시행합니다.

5.Autoclave후 agar의 온도는 45도를 유지합니다

(여기서 온도가높으면 초콜렛배지가됨)

6.Blood mixing

7. petridish 20ml 분주

8. Open Plates (약 15~20분 굳습니다)

(Tip : 알코올 램프를 통해 조금더 빨리 굳게만들수있습니다)

참고자료: http://blog.naver.com/juny3434/50032890594

Immunohistochemistry 

Deparaffinization

1. xylen100% 담긴 유리용기에 슬라이드 넣고 위아래로 10번씩 움직임

2. 새(new) xylen 100%에서 다시 10번

3. 100%EtOH, 95%EtOH, 85%EtOH, 75%EtOH에서 10번씩

4. 찬물에서 10번, 새 찬물 10번, 새 찬물에 5분간 담그기

Antigen retrieval (unmasking)

-> 이 단계는 생략하고 했다가, 결과를 보고 실시 여부 결정

고정하는 동안 methylene bridge가 형성되어 단백질간 교차결합이 발생하므로 이를 실시해줌

1. buffer를 넣고 끓이기 ( 95도~100도) - citrate/ sodium citrate solutiion

2. 슬라이드를 넣고 10~40분간 담그기 - 시간은 최적의 사진이 나오는 것으로 조절

3. 상온에서 30분간 식히기 - 슬라이드에서 조직이 떨어지는 것을 막을 수 있음

4. TBS로 washing

staining 

1. 물기 제거 후, DAKO pen으로 marking

2. 3% H2O2 block solution을 떨어뜨리고 10분간 반응 (peroxidase blocking, 조직 내 H2O2가 임의적으로 반응하는 것을 막기위함)

3. 종이에 털고, 물에 잠기게 해서 흐르는 물에 5분간 washing

4. blocking 1시간 (ABC kit - normal horse serum/TBS-T5ml에 노란 라벨 한방울)

5. blocking serum 종이 타올로 제거

6. Primary antibody 1시간 처리

7. 항체 다시 수거 후 TBS-T로 washing 5분 (orbital shaker로 아주 약하게 rpm10정도)

8. secondary antibody 30분 처리

9. TBS-T로 washing5분

10. 미리 만든 VECTASTAIN ABC reagent 30분 반응

11. TBS-T 5분 washing

12. DAB solution 으로 원하는 정도로 발색될 때 까지 반응

13. 찬물에 5분간 살짝 흔들며 washing

Hematoxylin counter staining

1. hematoxylin 용액 점적 후 1분간 반응

2. 세척수가 무색이 될 때 까지 흐르는 물로 washing

3. acid rinse 용액에 넣고 10번 정도 위아래로 씻음 (선명하게 해줌)

4. 찬물에 10번 담갔다 빼기

mounting

출처: http://blog.naver.com/ji1004hye/190346406