아가로스겔 전기영동 방법 1

2014.10.15

 

 

 

 

1) 아가로스 겔 전기영동

: PCR로 원하는 부위의 DNA를 얻고 나서 내가 원하는 DNA가 잘 합성이 되었는지 확인과 분석을 통해서 전기영동이라는 실험을 해야 한다.

 

 

전기영동( electrophoresis )의 원리 - DNA를 크기에 따라서 분리를 할 수 있는 방법인데, DNA의 골격중에 인산기는 음전하(-)를 가지고 있다. 음전하를 가진 물질은 음전하에서 양전하(+)측으로 이동하게 되어있다. 이런 이치로 마이너스전하를 띤 DNA는 플러스 전극 쪽으로 이동한다. 또한 DNA분자가 겔 (gel)을 통과할 때 분자량이 큰 것일수록 속도가 느려지게 된다. 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도도 달라진다.

 

▶ 실험방법

 

1. 아가로스 겔 만들기

​  1X TBE(Tris-borate : 장 시간 전기영동 시) 또는 1X TAE(Tris-acetate : 단 시간 전기영동 시) buffer에 적절한 농도가 될 수 있게 아가로스 가루를 잘 섞는다. 그리고 가열하여 완전히 아가로스를 녹인다. 아가로스가 녹는 것은 눈에 잘 보이지 않으므로 가열 중간 중간 휘젓어서 확인 한다. 가열시 끓음으로 인해서 농도변화가 생기지 않도록 주의 한다.

 아가로스는 굳지 않을 정도로 살짝만 식힌 후 겔 판에 잘 부어준다. 이 때 기포가 생기지 않게 조심히 부어주며, 혹시 생긴 경우 겔이 굳기전에 잘 정돈해준다.

 깨끗이 세척된 comb를 꽂아 시료 점적이 가능한 공간을 만들고 20 ~ 30분 정도 지나 겔이 굳으면 comb를 빼낸다.

 

2. 전기영동

전기영동조에다가 working solution TAE를 붓는다. 그 후 겔 판에서 겔을 꺼내어 전기 영도조에다가 담군다. comb를 빼낸 홈에 각각의 DNA를 넣는다. DNA샘플은 파이펫을 이용해서 조심히 넣어야 한다. 그리고 전기영동조를 작동시킨다.

 전기 영동의 전류는 gel의 두께와 길이에 반비례하고 관찰하고자 하는 DNA의 크기에 비례하게 걸어준다.

 전류가 너무 낮고 시간이 오래 걸리면 DNA밴드가 번진 것처럼 보이고 너무 놓으면 전기 저항이 높아져 gel온도가 올라가 부분적으로 gel이 녹게 된다.

 

실험에 사용된 기기들.

 

 

주의사항

 

1) 아가로스 겔 & TAE농도 맞추기.

Q1. 100X TAE 으로 1X TAE 의 100ml을 만드는데 필요한 양은?     (1X TAE와 + 99ml의 물)

Q2. 50X TAE으로 0.5X TAE의 1000ml을 만드는데 필요한 양은?     (10X TAE와 + 990ml의 물)

Q3. 50X TAE으로 0.5X TAE의 2L을 만드는데 필요한 양은?     (20X TAE와 + 1980ml의 물)

Q4. 20X TAE으로 0.5X TAE의 2L을 만드는데 필요한 양은?     (50X TAE와 + 1950ml의 물)

Q5. 40X TAE으로 0.2X TAE의 1500ml을 만드는데 필요한 양은?     (7.5X TAE와 + 1429.5ml의 물)

 

2) DNA는 눈에 보이지 않기 때문에 염색을 해야하는데 이 때 Et-Br로 염색을 하여 UV등을 비추면 DNA를 눈으로 확인할 수 있다.

 

3) Et-Br은 발암물질을 지니고 있기 때문에 주의하여야 한다.

 

4) comb를 겔 판에서 꺼낼 때 Gel이 찢어지지 않도록 조심한다.

[출처] 2014.10.15. 아가로스 겔 전기영동과 DNA |작성자 유쾌한귤맛