분자 RT pcr

(2) Phase separationⓐ Incubate the homogenized sample for 5 minutes at room temperature to permit complete dissociation of the necleoprotein complex.

ⓑ Add 500㎕ of chloroform per 1ml of TRIzol reagent used for homogenization. 

☞ chloroform에 의해 층이 분리된다.

ⓒ Cap the tube securely. Shake the tube vigorously by hand for 15 seconds.

ⓓ Incubate for 5 minutes at room temperature.

ⓔ Centrifuge the sample at 12,000 rpm for 15 minutes at 4'C.

Note : The mixture seperate into a lower red phenol chloroform mixture phase, an interphase, and a colorless upper aqueous phase. RNA remains in the aqueous phase. The upper aqueous phase is ~50% of the total volume.

ⓕ Place the aqueous phase into a new tube and proceed to the RNA isolation procedure.

ⓖ save the interphase and orgnic phenol-chloroform phase if isolation of dna or protein is desired. see dna isolation procedure and protein isolation procedure for details. the organic phase can be stored at 4c overnight

(2) 상분리

ⓐ 균질화 된 시료를 실온에서 5 분 동안 배양하여 necleoprotein complex가 완전히 해리되도록한다.

ⓑ 균질화에 사용 된 TRIzol 시약 1ml 당 클로로포름 500㎕를가한다.

☞ 클로로포름과 분리.

ⓒ 튜브를 단단히 고정하십시오. 튜브를 15 초 동안 손으로 힘차게 흔든다.

ⓓ 상온에서 5 분 동안 품어 낸다.

4,000 rpm으로 15 분간 4 ℃에서 원심 분리한다.

노트 : 혼합물은 낮은 적색 페놀 클로로 폼 혼합물 상, 계면 및 무색상의 수 상부층 으로 분리된다.

RNA는 상부층 상에 남아있다. 상부 층의 총 부피의 약 50 %이다.

aqueous 수성 상을 새로운 튜브에 넣고 RNA 분리 절차를 진행하십시오.

dna 또는 단백질의 분리가 필요한 경우 계면 및 유기 페놀 - 클로로포름 상를 저장하십시오. 자세한 내용은 DNA 분리 절차 및 단백질 분리 참조하십시오. 유기상은 밤새 4c에서 저장할 수있다.

(3) RNA isolation procedure

Add 200 μL of isopropanol to the aqueous phase.

☞ The ratio of isopropanol to chloroform is 1: 1.

☞ Through this process, the RNA dissolved in the aqueous layer solidifies.

Ⓑ Incubate at room temperature for 10 minutes, and centrifuge at 12,000 x g for 10 minutes at 4'C.

- Remove supernatant

※ RNA WASH

Ⓒ Remove the supernatant from the tube, leaving only the RNA pellet.

Ⓓ Wash the pellet with 1 ml of 75% ethanol per ml of TRIzol reagent used in homogenization.

☞ After dehydration process, the pellet becomes clearer.

Note: The RNA can be stored in 75% ethanol at least 1 year at -20 ° C, or at least 1 week at 4 ° C.

In relation to time, this process is carried out and kept at -20 ° C refrigerator.

Ⓔ Vortex the sample briefly, then centrifuge the tbe at 7500 x g for 5 minutes at 4'C. Discard the wash.

☞ Completely remove the ethanol. It may interfere with cDNA synthesis.

Ⓕ Air dry the RNA pellet for 5-10 minutes.

Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility.

☞ The pellet is dried and becomes transparent. When it becomes somewhat transparent (completely dry X)

(3) RNA 분리 절차

수성 상에 200 μL의 이소프로판올을 첨가한다.

☞ 클로로포름에 대한 이소프로판올의 비율은 1 : 1

☞이 과정을 통해 수성층에 용해 된 RNA가 고형화된다.

Ⓑ 실온에서 10 분간 배양하고 4 ℃에서 12,000 x g으로 10 분간 원심 분리한다.

- 상층액 제거

※ RNA WASH

Ⓒ 상층 액을 제거하고 RNA pellet만을 남긴다.

hom 균질화에 사용 된 TRIzol 시약 1ml 당 75 % 에탄올 1ml로 펠렛을 씻는다.

☞ 탈수 후 펠릿이 깨끗해진다.

참고 : RNA는 -20 ° C에서 적어도 1 년 또는 4 ° C에서 최소 1 주일 동안 75 % 에탄올에 저장할 수 있습니다.

시간과 관련하여 이 과정을 수행하고 -20 ° C의 냉장고에 보관합니다.

sample 샘플을 짧게 볼 텍싱 한 후 7500 x g에서 5 분 동안 4 ℃에서 원심 분리한다. 세척 물을 버립니다.

☞ 에탄올을 완전히 제거하십시오. 그것은 cDNA 합성을 방해 할 수 있다.

RNA 원심 분리기를 5-10 분 동안 공기 건조

참고 : 펠렛이 용해성을 잃을 수 있기 때문에 RNA가 완전히 마르지 않게하십시오.

☞ 펠릿이 말라서 투명하게됩니다. 그것이 다소 투명 해지면 (완전히 건조한 X)