Agarose gel electrophoresis(아가로스 겔 전기영동

<7> Agarose gel electrophoresis

● 실험목적

Bacteria로부터 분리한 plasmid DNA를 agarose gel 전기영동을 이용해 확인해 본다.

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● 실험원리

DNA gel 전기영동 방법은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 지니고 있다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지고 gel matrix가 치밀할수록(gel %가 높을수록)늦어지며, 또한 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다.

gel에 홈을 만들어 DNA나 RNA, 단백질 등의 분자를 집어넣고 전류를 흘려주면 음전하를 띤 이들 분자들은 전기적인 힘에 의해 gel안에서 이동하게 된다. 같은 크기를 가진 분자들은 하나의 집단을 형성하여 움직이게 되는데 만약 동일한 분자들을 전기영동 하였다면 겔을 염색하였을 때 이것이 하나의 띠 모양으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들을 나란하게 전기영동 하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적인 위치를 비교함으로써 그 크기를 측정할 수 있다.

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● 실험재료

plasmid DNA, agarose, comb, gel tray, gel 틀, 전기영동장치, 1X TAE buffer,

6X gel loading buffer, 1kb DNA ladder, EtBr solution(25ug/ml), UV lamp

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● 실험방법

1. Agarose gel 만들기

1) agarose 1%(w/v)를 저울로 재어 플라스크에 넣은 후 1X TAE buffer에 넣고 입구를 랩으로 감싸고 구멍을 뚫는다.

2) 플라스크를 전자렌지에 넣어 녹인다.

3) Agarose가 완전히 녹으면 gel tray와 comb를 장착한 틀에 적당량을 붓고 상온에서 굳힌다.

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2. Plasmid DNA loading & 전기영동

1) 전기영동 장치에 1X TAE buffer를 채우고, 만들어 놓은 agarose gel을 넣는다.

2) 6X loading buffer를 DNA sample에 총 부피가 1X가 되도록 pipetting하여 섞어 준 후, agarose gel에 3ul씩 loading 하고, sample의 양옆에는 marker를 3ul씩 loading하여 100V에서 전기영동 한다.

3) 전기영동이 끝나면 장치의 전원을 끄고 gel을 꺼내서 EtBr 용액에 넣고 15분간 염색시킨다.

4) UV lamp로 전기영동이 끝난 gel의 DNA 밴드를 확인한다.

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● 실험결과

1~6조 모두 4개의 밴드가 나왔다

위에서부터 차례대로 open circular, linear DNA, Denaturation Supercoiled DNA, supercoiled DNA순이다.

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● 실험고찰

1. Loading buffer의 역할

loading buffer는 분자량이 큰 글리세롤, 수크로오스 등 무거운 물질이 함유되어 있어 전기영동시 DNA와 같이 혼합하여 gel 속에 잘 가라앉히는 역할을 한다.

또한 Bromophenol blue, Xylene cyanol, Orange G tracking dye를 포함하기 때문에 전기이동하는 동안에 dye의 위치를 육안으로 관찰하여 DNA가 gel상에 전기영동 되는 위치를 추측가능하게 하는 역할도 한다.

출처 : http://blog.naver.com/withcoffee67/70158243055

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2.TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 사용하는 이유

TAE의 Tris는 양이온을 공급하고, Acetate는 pH를 낮추기 위해 사용된다.(pH가 높으면 DNA가 해리된다.)

EDTA는 Mg2+등 2가 이온을 잡아 묶어 킬레이트제 역할을 하여 효소를 불활성화 시킨다.이로인해 전기영동 하는 동안 DNA는 DNase로부터 보호된다.

일반적으로 TBE(Tris-borate-EDTA) 가 TAE(Tris-acetate-EDTA)보다 완충능력이 더 좋아 전기영동을 길게 할 경우 TBE가 더 적합하지만 DNA를 elution할 때는 borate가 방해하기 때문에 TAE를 주로 사용한다.

http://en.wikipedia.org/wiki/TAE_buffer

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3.EtBr staining 원리

EtBr(Ethidium Bromide)는 평면적인 분자구조를 가지고 있는 물질로 자외선을 받아 가시광선으로 파장을 변화시키는 일종의 형광물질로써 푸른빛 계통의 짧은 파장의 빛을 붉은빛 계통의 긴 파장의 빛으로 바꾸어 내보낸다.

254nm파장의 UV가 DNA에 부딪힐 때 302~366nm의 파장으로 반사되는데 이 빛은 EtBr의 흡수 된 후 590nm정도의 가시광선으로 바뀐다.

즉, gel을 EtBr 용액 속에서 staining 하면 EtBr이 DNA 이중나선의 염기 사이에 끼어들어가기 때문에, gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광색이 발광되어 육안으로 확인 할수 있도록 해주는 역할을 한다.

EtBr은 대표적인 발암물질중의 하나로 실험시 주의하여야 한다.

출처 : http://blog.naver.com/withcoffee67/70158243055

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4.Agarose gel 전기영동에서 DNA 이동에 영향을 주는 요인들

1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.

2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.

3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.

4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.

5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.

6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.

7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.

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출처 : http://phy357.egloos.com/v/591611

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5. 아가로스 전기영동 하였을 때 원래 open circular DNA, linear DNA, supercoiled DNA 3개의 밴드가 보여야 되는데 이번 실험에서는 총 4개의 밴드가 보였다. 이는 플라스미드를 alkaline lysis과정으로 뽑았는데 이과정에 의한 높은 pH로 super coiled 형태의 일부분이 denaturation되었기 때문이다. 

[출처] [미생물 실험]Agarose gel electrophoresis(아가로스 겔 전기영동)|작성자 방황하던20대